Un metodo innovativo per l'immagine di campioni spessi

Eliminare la sfocatura dell'immagine senza ricorrere al confocale

Contenuto sponsorizzato: I microscopi a fluorescenza a campo largo (WF) forniscono immagini ad alta risoluzione per i campioni sottili, ma sono limitati nella loro capacità di immagine dei campioni più spessi a causa della fluorescenza di fondo che provoca la sfocatura dell'immagine. Il sezionamento ottico supera efficacemente questo problema, ma tradizionalmente richiedeva un sistema confocale o un software di sfocatura. Con la tecnologia di sezionamento ottico ora presente sugli scanner per vetrini, i ricercatori possono beneficiare delle funzionalità confocali per l'imaging di campioni spessi, con una produttività notevolmente migliorata.

Limiti dell'imaging a campo largo

La microscopia WF è una tecnica di imaging onnipresente, molto efficace per i campioni sottili (<10 µm). Nella microscopia WF, la luce proveniente sia dal piano a fuoco che da quello fuori fuoco viene raccolta dalla telecamera, il che non costituisce un problema per i campioni sottili. Quando si imitano campioni più spessi, questa inevitabile fluorescenza di fondo causa una sfocatura dell'immagine e uno scarso contrasto, oscurando le strutture di interesse. La microscopia confocale e altre tecniche di illuminazione a scansione possono superare questo problema. Esse funzionano modellando l'illuminazione in uno schema fisso, ottenendo un'immagine otticamente sezionata. Questi sistemi possono produrre immagini eccellenti in condizioni favorevoli. Tuttavia, hanno un costo significativo e si basano sull'invio di schemi di illuminazione ben definiti e controllati nel campione.

Un nuovo approccio all'illuminazione

Per annullare gli effetti della fluorescenza di fondo sul contrasto e sulla qualità dell'immagine, non sempre sono necessari schemi di illuminazione ben definiti e controllati. Una tecnica nota come microscopia HILO utilizza schemi speckle casuali per illuminare il campione fluorescente. I pattern speckle presentano un'intensità granulare con un contrasto intrinsecamente elevato, facendo apparire granulari le immagini di fluorescenza ottenute tramite illuminazione speckle. Questa granularità fornisce un contrasto e un'indicazione diretta della messa a fuoco del campione.

Durante l'imaging HILO, vengono raccolte ed elaborate due immagini grezze. La prima è un'immagine WF regolare con illuminazione uniforme. A questa immagine viene applicato un filtro passa-alto per estrarre le informazioni ad alta frequenza, la parte "HI" della microscopia HILO. Questo passaggio elimina le informazioni a bassa frequenza, comprese quelle in-focus e out-of-focus. La seconda immagine viene acquisita utilizzando l'illuminazione speckle per recuperare le informazioni a bassa frequenza dell'immagine a fuoco, la parte "LO" della microscopia HILO. Queste immagini vengono elaborate con un algoritmo che estrae le informazioni sulla messa a fuoco ed elimina la fluorescenza di fondo. Le due immagini vengono poi fuse insieme (Fig. 1) per ottenere un'immagine contenente le informazioni dell'intera gamma di frequenze, con la rimozione della luce fuori fuoco.

Il dispositivo di sezionamento ottico SILA è una soluzione di imaging ad alto rendimento per gli scanner per vetrini da ricerca Slideview VS200 basati sulla microscopia HILO. Si tratta di una tecnologia aggiuntiva per microscopi a campo largo (WF) che elimina la luce fuori fuoco e produce sezioni ottiche nitide come quelle della microscopia confocale. Il dispositivo SILA può essere facilmente aggiunto a qualsiasi sistema VS200 e offre vantaggi a un'ampia gamma di applicazioni che richiedono l'imaging ottico di alta qualità di campioni più spessi.

Sezionamento ottico regolabile

Poiché il dispositivo SILA elabora matematicamente l'immagine WF tradizionale e l'immagine speckle, è possibile regolare il grado di sezionamento ottico utilizzando un unico parametro, chiamato spessore di sezionamento (ST). Quando lo ST è impostato su un valore elevato, le immagini visualizzano le informazioni da una maggiore profondità di campo, dando l'aspetto di un'immagine WF.

La Figura 2 mostra una sezione cerebrale realizzata con ST5. A questo valore ST elevato, rimangono molte aree fuori fuoco. Quando il valore ST si riduce, l'immagine mostra informazioni provenienti da una minore profondità di campo. Pertanto, osservando la sezione cerebrale prelevata a ST2 e ST1, le informazioni a fuoco rimangono, mentre gli elementi fuori fuoco sono scomparsi. La capacità di ottimizzare il sezionamento ottico in questo modo consente la visualizzazione a diverse profondità, eliminando la fluorescenza di fondo. Questa caratteristica del dispositivo SILA per lo scanner VS200 è paragonabile a quella dei sistemi di microscopio confocale, in cui la modifica delle dimensioni del foro stenopeico può ottenere un effetto simile.

Capacità di deconvoluzione

Prima dello sviluppo del dispositivo SILA, gli scanner VS200 disponevano di una soluzione alternativa per rimuovere la luce fuori fuoco dalle immagini WF. Utilizzando il software di deconvoluzione Trusight, è possibile deconvolvere le immagini utilizzando algoritmi iterativi vincolati (CI) 2D. Questo approccio basato sul software è in grado di rimuovere una parte della luce sfocata. Tuttavia, non rimuove la stessa quantità di luce sfocata né fornisce l'ottimizzazione del sezionamento ottico come il software e l'hardware combinati utilizzati nel modulo SILA. Tuttavia, la deconvoluzione fornisce una valida opzione intermedia per la visualizzazione di campioni più sottili in cui il sezionamento ottico SILA non è disponibile. Le differenze nella qualità dell'immagine tra le immagini WF convenzionali, quelle deconvolute via software e quelle SILA sono illustrate nella figura 3.

Applicazioni dell'imaging SILA

La tecnologia di sezionamento ottico SILA può apportare un valore significativo a molte applicazioni di ricerca, in particolare nell'imaging di strati cellulari fissi e spessi e di campioni di tessuto. Grazie alle funzioni di ottimizzazione del sezionamento e all'eliminazione della sfocatura e del contrasto dell'immagine paragonabili a quelli dei microscopi confocali, SILA offre un imaging di alta qualità con una produttività notevolmente migliorata.

La capacità di acquisire immagini di campioni più spessi è vantaggiosa nell'imaging delle neuroscienze, dove spesso sono necessarie sezioni di tessuto spesse per preservare la morfologia del campione. L'imaging di sezioni cerebrali è notoriamente impegnativo. È particolarmente difficile a causa della propensione del tessuto cerebrale a produrre un effetto di diffusione della luce. Tradizionalmente, per catturare un'immagine di alta qualità e ad alto contrasto, sarebbero necessari sistemi di microscopia confocale o a due fotoni, ma questi sistemi richiederebbero una quantità di tempo considerevole per l'immagine di un'area ampia come una sezione cerebrale. La scansione automatizzata del vetrino fornita dal sistema VS200 con il dispositivo SILA rende molto più veloce l'acquisizione di campioni spessi su un'ampia area, fornendo immagini di alta qualità in una frazione di tempo (Figura 4).

La ricerca sugli organoidi è un'altra area che beneficia dell'imaging SILA, poiché l'imaging degli organoidi presenta sfide simili a quelle delle neuroscienze. L'imaging degli organoidi è difficile a causa dello spessore dei campioni, mentre è necessario imitare ampie aree per poter analizzare correttamente la morfologia degli organoidi. Come scanner per vetrini interi, il sistema VS200 con il modulo SILA può fornire la copertura necessaria per l'imaging di questi campioni di grandi dimensioni. Inoltre, l'elaborazione automatica delle immagini, la funzione di diffusione del punto (PSF) indipendente dal campione e il semplice flusso di lavoro consentono una rapida acquisizione delle immagini. Il dispositivo SILA è utile anche per la ricerca sul cancro, la biologia spaziale, la botanica, l'embriologia e molti altri settori che richiedono l'acquisizione di immagini di alta qualità di campioni spessi su ampie aree.

Sintesi

L'imaging SILA può ottimizzare il sezionamento ottico, ridurre l'offuscamento del campione e migliorare il contrasto dell'immagine rispetto ai sofisticati microscopi confocali a scansione laser. Grazie a una produttività significativamente migliore rispetto ai sistemi confocali, lo scanner per vetrini VS200 con il dispositivo SILA consente di eseguire rapidamente l'imaging di campioni di grandi dimensioni e tradizionalmente difficili da visualizzare, apportando vantaggi significativi alle neuroscienze, alla ricerca sugli organoidi e ad altri settori.