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Anticorpi di purificazione facendo uso di Ion Exchange Chromatography

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La cromatografia a scambio ionico (IEC) è un metodo cromatografico impiegato per separare i composti biologici. La base della separazione nell'IEC è l'adsorbimento reversibile (assorbimento di superficie) delle molecole fatte pagare su una fase stazionaria.

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La fase stazionaria è fatta dei gruppi di scambio ionico immobilizzati che hanno la tassa opposta come la componente dell'obiettivo che deve essere portata nella fase mobile. Generalmente, gli esperimenti di scambio ionico sono eseguiti in cinque fasi.

Che cosa è IEC e come è eseguito?

La prima fase di IEC è chiamata equilibrio. Durante questo processo, la fase stazionaria di scambio ionico è equilibrata per assicurare che stia funzionando agli stati di forza ionica e di pH ottimizzato per massimizzare l'adsorbimento della componente polare dell'obiettivo della fase stazionaria.

La superficie di scambio è una resina che comprende una matrice i gruppi funzionali o i leganti ionizzabili fatti pagare. Questa fase stazionaria visualizza questi gruppi funzionali che formano le interazioni ioniche con lo ione dell'analito della tassa avversaria. È importante mantenere il electroneutrality, che è lo stato in cui la tassa netta del sistema è zero. Counterions è presente nella soluzione di equilibrio.

Nella seconda tappa, il presente polare dell'analito dell'obiettivo nella fase mobile del campione deve fare concorrenza ai counterions per l'adsorbimento alla fase mobile. Questo risultati trattati nello spostamento di counterion; qualsiasi componenti che non possono legare il passaggio attraverso la colonna ed immediatamente sono eluite.

Nella terza fase, il desorbimento degli analiti rilegati accade. Ciò è raggiunta alterando i termini obbligatori, principalmente cambiando il pH o aumentando la forza ionica dell'amplificatore dell'eluizione.

Nel metodo posteriore, un amplificatore dell'eluizione di concentrazione aumentante nel sale si applica alla colonna e gli analiti sono liberati dalla resina per forza obbligatoria aumentante. Ciò accade perché la concentrazione di counterion aumenta e fa concorrenza agli analiti rilegati. Gli analiti male obbligatori sono liberati in primo luogo, mentre quegli analiti capaci di forte legame ionico sono ultimo eluito.

Il del quarto piano è categorizzato per la fine di desorbimento e nel quinto e nello stadio finale, la colonna è rigenerata. La rigenerazione risistema la colonna in modo da può essere usata per un'altra purificazione. La separazione di analiti polari all'interno di una miscela complessa è possibile perché le loro differenze nella tassa netta, nella densità di carica e nella distribuzione della carica tiene conto interazione differenziale con la superficie di scambio ionico stazionaria. La dinamica della loro interazione con la superficie di scambio ionico può essere manipolata variando la forza ionica ed il pH della fase mobile durante l'eluizione.

Le proprietà della tassa delle molecole biologiche sono notevoli; la cromatografia a scambio ionico è vantaggiosa quando separa le proteine, poichè fornisce la separazione ad alta definizione fra le proteine che differiscono soltanto da un singolo aminoacido.

a separazione basata a IEC dell'anticorpo

Ci sono parecchi processi cromatografici che facilitano l'isolamento degli anticorpi approfittando delle proprietà biochimiche differenti. La separazione basata sulla dimensione, l'idrofobicità, la solubilità e l'affinità di grippaggio sono esempi che sono stati usati. D'importanza, le varie proprietà della tassa degli anticorpi li rendono favorevoli a purificazione dall'IEC;

Gli anticorpi sono molecole biologiche proteiniche e le loro proteine della tassa possono essere manipolate facendo uso dell'IEC. La tassa netta delle molecole di interesse determina il tipo di IEC che può essere usato. Se positivamente - i composti fatti pagare sono l'obiettivo da catturare entro la fase mobile, una resina di scambio cationico è scelto. Per contro, le molecole fatte pagare di alla resina fatta pagare di scambio anionico è selezionata quando negativamente - devono positivamente essere immobilizzate.

Le resine più comuni utilizzate nei protocolli di purificazione dell'anticorpo sono perle dell'agarosi della proteina A. Ci sono varie altre resine disponibili nel commercio che possono essere usate, tuttavia. La capacità obbligatoria della resina, insieme alla lunghezza della colonna, determina il numero dei cicli dell'IEC che devono essere decisi per elaborare gli anticorpi che sono resi dal surnatante delle cellule costruite per esprimere le alte quantità dell'anticorpo desiderato.

Le resine di scambio cationico sono state riferite per produrre gli alti rendimenti e per ridurre la quantità di proteina della cellula ospite (HCP); HCPs è impurità in relazione con il processo che sono derivate dalla cellula ospite dall'espressione delle proteine recombinanti e biotherapeutic, quali gli anticorpi. Ulteriormente, il processo è altamente selettivo, tale quel grippaggio è specifico alla regione costante di anticorpi.

Gli anticorpi stanno diventando sempre più prevalenti come agenti terapeutici nel trattamento di varie malattie come l'artrite ed il cancro. Di conseguenza, il valore di mercato degli anticorpi sta aumentando. Gli anticorpi monoclonali (MAb) sono prodotti dalle cellule di mammiferi e possiedono la stessa struttura. La purezza di queste popolazioni clonali è essenziale per efficacia clinica.

I titoli di MAb sono in genere su quanto 5 - 10 g/l, ma la loro purificazione a valle crea un impasse nella loro produzione finale. L'IEC fornisce un metodo da cui gli anticorpi possono essere purificati con alti rendimento e selettività.