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Diagnosi prenatale delle malattie rare: Gli albori dei metodi non invasivi

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La diagnosi prenatale definitiva si basa attualmente su tecniche invasive, ma questo può cambiare

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Il 28 febbraio 2019, il mondo ha celebrato la Giornata delle Malattie Rare per far conoscere più di 6.000 condizioni che colpiscono meno di 200.000 cittadini statunitensi. (È circa uno su 1.640 persone.)

I progressi nella diagnostica molecolare stanno rilevando un maggior numero di malattie rare a costi inferiori rispetto al passato. Per le famiglie con anamnesi di malattia genetica o quando si rilevano anomalie de novo attraverso lo screening, la diagnosi prenatale fornisce ai futuri genitori e ai medici le informazioni necessarie per scegliere le migliori cure prenatali e postnatali. La diagnosi prenatale definitiva si basa su tecniche invasive che comportano un piccolo rischio di aborto spontaneo. Tuttavia, stanno emergendo tecniche non invasive che potrebbero presto sostituire i metodi tradizionali

Metodi diagnostici e di screening attuali

I test diagnostici confermano una malattia genetica con una precisione prossima al 100%. Fino a poco tempo fa, la diagnosi prenatale definitiva era possibile solo attraverso metodi invasivi come il prelievo di villo corionico (CVS) o l'amniocentesi (analisi del liquido amniotico), che causano aborto spontaneo rispettivamente nello 0,2 e 0,1 per cento delle gravidanze. I recenti progressi nell'analisi molecolare stanno fornendo un repertorio di test per l'individuazione di malattie rare dal DNA fetale

I test di screening, invece, forniscono un punteggio di rischio per le anomalie alla nascita e identificano gravidanze con una maggiore probabilità di contrarre malattie (principalmente cromosomiche); pertanto, i test di screening possono indicare se sono necessari test diagnostici più accurati

L'ecografia è il metodo di screening più comune, anche se l'accuratezza dipende dall'abilità dell'ecografo. I principali difetti fisici o aneuploidia possono essere valutati con questo metodo, ma non malattie monogeniche come la fibrosi cistica

Lo screening prenatale non invasivo (NIPS) comprende l'analisi del DNA fetale privo di cellule (cffDNA) isolato dal sangue materno. Questi 150-180 coppie di base (bp) frammenti di trofoblasti placentari costituiscono dal quattro al 20% del DNA libero. I falsi positivi e negativi si verificano a causa della bassa frazione di cffDNA, del mosaicismo placentare, delle anomalie genetiche materne e dei feti multipli, per cui il NIPS non è attualmente raccomandato per la diagnosi

Tecniche molecolari che promuovono l'individuazione di malattie rare non invasive

I miglioramenti nella PCR, microarray, sequenziamento, aplotipizzazione e altri metodi molecolari stanno beneficiando sia la ricerca sulle malattie rare che la loro identificazione tramite metodi non invasivi basati su cffDNA.

Gli scienziati hanno recentemente sviluppato un'amplificazione mirata del locus per semplificare l'aplotipizzazione, rendendola più pratica per la diagnosi di malattia monogenica ereditaria nei feti. In altre aree, le tecnologie di microarray cromosomico stanno rivelando la patologia delle microdelezioni e della microduplicazione; ad esempio, il PrenaTest della società tedesca LifeCodexx utilizza la PCR quantitativa del cffDNA per rilevare la singola microdelezione del cromosoma 22 che porta alla sindrome di DiGeorges. La delezione si verifica in un parto su 3.000 e può causare difficoltà di apprendimento, difetti cardiaci e immunodeficienza.

La combinazione del sequenziamento di nuova generazione (NGS) con la bioinformatica avanzata migliora l'accuratezza della diagnosi di cffDNA. Ad esempio, l'acondroplasia (un disturbo osseo che causa un nanismo sproporzionato) e la displasia thanatophoric (un grave disturbo scheletrico) sono state confermate con una precisione del 96,2% utilizzando NGS

Nuovi metodi di PCR stanno inoltre portando a una migliore diagnosi prenatale non invasiva. Il microchip Fluidigm, un metodo digitale PCR sensibile in grado di amplificare singoli frammenti, può diagnosticare emofilia e anemia falciforme da cffDNA. LifeCodexx ha riportato una maggiore precisione, economia e velocità per un NIPS che utilizza la PCR in tempo reale rispetto all'NGS o al microarray

Altri gruppi di ricerca si stanno concentrando sull'aumento della produzione di cffDNA da campioni di sangue materno, migliorando così l'affidabilità dei NIDS. Quando la frazione cffDNA è stata arricchita con la selezione delle dimensioni del gel di agarosio, i ricercatori hanno trovato il valore predittivo positivo, che indica l'affidabilità di un test diagnostico, migliorato del 6% rispetto ai NIDS standard. Altre strategie includono il miglioramento della stabilità della frazione fetale nelle provette per la raccolta del sangue per massimizzare il cffDNA disponibile per l'analisi

Recenti ricerche hanno scoperto più caratteristiche che possono aumentare ulteriormente la specificità del NIPS, come l'ipometilazione dei frammenti di cffDNA. Tuttavia, non tutte le mutazioni e le anomalie possono essere rilevate usando il NIPS; per esempio, la sindrome X fragile, che colpisce le capacità cognitive, è causata da 1.000 ripetizioni di bp che non sono contenute nei brevi frammenti di cffDNA.

Diagnosi basata su cellule fetali

La presenza di cellule fetali intatte nel sangue materno è stata scoperta alla fine degli anni Sessanta. Da allora, si è cercato di sfruttare queste cellule per la diagnosi, in quanto forniscono genomi fetali interi separati dal DNA materno, piuttosto che frammenti. Sfortunatamente, queste cellule, la maggior parte delle quali sono globuli rossi nucleati (nRBC), trofoblasti e leucociti, sono incredibilmente scarse a circa una cellula per millilitro di sangue. Questa rarità e la mancanza di marcatori cellulari specifici per il feto hanno ritardato la tecnologia. Il seguente elenco include solo alcune delle ricerche in corso per lo sviluppo di test diagnostici non invasivi fattibili su cellule fetali:

Un metodo diagnostico basato su cellule fetali di recente sviluppo impiega una combinazione di lisi RBC, selezione delle cellule ad attivazione magnetica (MACS), selezione delle cellule ad attivazione fluorescente (FACS) e separazione manuale delle cellule fetali. MACS e FACS si affidano agli anticorpi monoclonali contro i marcatori di superficie cellulare, ma la contaminazione è un problema perché le cellule fetali e materne condividono i marcatori. Pertanto, questo metodo prevede la selezione manuale delle cellule per separare le cellule fetali e materne come fase finale; tuttavia, la selezione manuale delle cellule può essere troppo laboriosa per il laboratorio diagnostico medio.

Per superare il problema della cattura di anticorpi non specifici, è stata sviluppata una tecnica che utilizza la centrifugazione a gradiente di densità per iniziare la separazione cellulare, seguita dall'isolamento eritroblasto a base di lectina, dalla colorazione chimica per le cellule del sangue, dalla cattura automatica delle immagini e dalla microdissezione a cattura laser (LCM). Questa tecnica è stata utilizzata con successo per isolare gli nRBC

I fondatori di Fetolumina Technologies Corp. sperano che i loro microchip nanoVelcro per arricchire i trofoblasti fetali da sangue materno conducano a una diagnosi affidabile e non invasiva. I chip sono impressi con anticorpi per catturare i trofoblasti. L'etichettatura immunocitochimica distingue i trofoblasti dai globuli bianchi materni per la LCM. Non solo sono state catturate cellule sufficienti utilizzando questi chip, ma la tecnica di ibridazione genomica comparativa array (aCGH) ha anche diagnosticato con successo la trisomia 13, 18 e X, e una rara delezione e duplicazione cromosomica.

Gli scienziati stanno sviluppando Cell Reveal™, un chip microfluidico rivestito con anticorpi marcatori cellulari per nRBC e trofoblasti. Il sistema comprende un microscopio a fluorescenza dotato di un analizzatore automatico di immagini che seleziona le cellule. La completa automazione della tecnica rende più fattibile per la diagnostica, a condizione che sia efficiente in termini di costi. Poiché Cell Reveal™ cattura nRBC e trofoblasti di derivazione placentare, qualsiasi falso-positivo causato dal mosaicismo placentare può essere confermato, anche se ciò non è ancora stato dimostrato.

La fondatrice di Rarecells Diagnostics, Patrizia Paterlini-Bréchot, ha annunciato lo scorso anno che l'azienda ha sviluppato un test fetale completamente automatizzato che isola le cellule in base alle dimensioni, non agli anticorpi, evitando così la cattura delle cellule materne. Il prodotto, chiamato ISET, è stato segnalato per raccogliere una media di 25-35 trofoblasti fetali da 10 millilitri di sangue

Gli scienziati hanno recentemente sviluppato una selezione cellulare a base capillare per separare i trofoblasti fetali arricchiti e colorati con anticorpi contro i marcatori della superficie cellulare. Utilizzando il sequenziamento dell'intero genoma e aCGH, il test identifica accuratamente aneuploidy, traslocazioni, cancellazioni e duplicazioni. Arcedi Biotech ha lanciato il prodotto nella regione centrale della Danimarca nel maggio 2018 e mira a creare una versione ad alto volume e completamente automatizzata.

Conclusioni

Le malattie rare, nel complesso, colpiscono 25-30 milioni di persone negli Stati Uniti. Circa l'80% delle malattie rare ha un'origine genetica, e la predisposizione per una condizione significa che i membri della famiglia sono spesso interessati alla diagnosi prenatale. La diagnosi aiuta i medici e i genitori a pianificare il trattamento e la cura, e in una manciata di casi, in utero il trattamento è disponibile. Tuttavia, a volte le prospettive di qualità della vita sono talmente scarse che l'interruzione del rapporto di lavoro è l'opzione migliore. In tutti i casi, una diagnosi precoce e accurata è la chiave per ottenere il miglior risultato possibile

L'implementazione della diagnostica delle malattie rare dipenderà dalle iniziative governative, così come dalle aziende biotecnologiche e dai laboratori clinici che antepongono la salute delle persone al guadagno economico. I metodi NIPS in costante evoluzione, l'emergere di test basati su cellule fetali e nuovi modi di rilevare anomalie genetiche rare fanno sì che i genitori in attesa in tutto il mondo possano presto beneficiare di una diagnosi prenatale non invasiva e precisa.