{{{sourceTextContent.title}}}

Thinking Outside Of The Freezer: Conservazione del DNA e dell'RNA

{{{sourceTextContent.subTitle}}}

Mentre le temperature ultrabasse sono la soluzione all'avanguardia attuale per la conservazione biospecimen, la conservazione ambientale è un'opzione interessante e potrebbe essere superiore in alcune situazioni limitate. Per molti tipi di campioni è possibile che dovremo sempre utilizzare temperature ultra basse per la conservazione a lungo termine. Per altri tipi di campioni, come il DNA e l'RNA, esistono soluzioni alternative.

{{{sourceTextContent.description}}}

La medicina di precisione si basa sulla capacità di sequenziare e interpretare accuratamente le informazioni memorizzate nel DNA e nell'RNA di un determinato individuo. Come è aumentata la necessità di comprendere il background genetico di base per i pazienti e i partecipanti agli studi clinici, così è aumentata anche la necessità di raccogliere campioni di DNA e RNA di alta qualità. Il sequenziamento di nuova generazione (NGS) e gli studi basati su RNA-seq sono gli strumenti primari utilizzati per ottenere questi dati e queste tecnologie si basano su campioni di alta qualità.

CONSERVAZIONE DEL DNA

La raccolta e lo stoccaggio di campioni che mantengono l'integrità dell'acido nucleico è costoso, soprattutto quando i siti di raccolta si trovano in aree remote. Sebbene la conservazione del DNA a -20°C e -80°C rimanga un metodo comune per conservare i campioni di DNA estratti, sono stati compiuti molteplici sforzi per sviluppare metodi per conservare i campioni di DNA purificati a temperatura ambiente.

Cicli multipli di congelamento-scongelamento possono portare alla tosatura e alla successiva degradazione del DNA. Una soluzione è quella di conservare il DNA in azoto liquido allo stato vetroso. Un'altra soluzione è quella di conservare il DNA a temperatura ambiente ed essiccato. In termini di stabilità, il vantaggio del DNA essiccato è che la disidratazione rimuove anche l'acqua che partecipa alle reazioni idrolitiche che portano alla rottura del filamento sia nel DNA che nell'RNA (Kansagara, McMahon et al., 2008).

La conservazione del DNA a temperatura ambiente senza alcuna forma di stabilizzazione può portare alla degradazione per una moltitudine di motivi, compresa la contaminazione delle nucleasi cellulari a seconda della forma del campione. Per combattere questo fenomeno, i gruppi hanno utilizzato diversi metodi di essiccazione dei campioni da includere:

essiccazione a spruzzo

liofilizzazione a spruzzo

asciugatura ad aria

liofilizzazione

e l'essiccazione con l'aggiunta di composti stabilizzanti disponibili in commercio.

Altre opzioni per la stabilizzazione del DNA includono l'uso di schede FTA e la precipitazione del DNA in etanolo. Tuttavia, queste opzioni possono richiedere molto tempo per estrarre il DNA a valle e non sono adatte a tutte le applicazioni, specialmente nei laboratori ad alta produttività e in ambienti clinici. Un approccio relativamente nuovo e promettente è quello di utilizzare stabilizzatori disponibili in commercio. L'aggiunta di uno stabilizzante al DNA umido consente di essiccare i campioni e di conservarli a temperatura ambiente senza rischio di degradazione. Ciò consente una più facile ed economica conservazione dei campioni in ambienti con problemi di risorse, in particolare i numerosi studi clinici che vengono condotti in luoghi con poca infrastruttura per una corretta elaborazione e conservazione dei campioni.

CONSERVAZIONE DI RNA

Simile al DNA, la qualità dell'RNA è influenzata dai cicli di congelamento/scongelamento e dalle risposte di stress cellulare, nonché dai protocolli di lavorazione dei tessuti e dalle condizioni di conservazione che si verificano prima dell'estrazione dell'RNA. L'inclusione di paraffina fissata in formalina (FFPE) è ancora il metodo primario di conservazione dei tessuti nei laboratori di patologia, ma rende difficile l'estrazione dell'RNA a causa della frammentazione. Il congelamento istantaneo fornisce RNA di qualità superiore rispetto all'FFPE, ma spesso non è pratico per i laboratori e i siti clinici che hanno accesso limitato alle strutture di congelamento richieste e limita il prelievo dei campioni in un luogo centralizzato.

I composti commerciali, come RNAlaterTM , consentono di immergere immediatamente piccoli pezzi di tessuto nella soluzione stabilizzante senza la necessità di congelare i campioni. Questi campioni di tessuto conservati possono essere conservati a temperatura ambiente fino a una settimana, 4°C per un mese e -80°C per periodi più lunghi fino a sei mesi prima dell'estrazione. Questa soluzione preclude la necessità di attrezzature specializzate per la conservazione e consente ai siti di raccolta di isolare l'RNA in un secondo tempo senza compromettere la qualità o la quantità di RNA ottenuta, eliminando così la necessità di trattare immediatamente i campioni di tessuto (Salehi, 2014).

Molti studi clinici raccolgono e conservano anche cellule per test su cellule vive. Lo standard d'oro per lo stoccaggio a lungo termine delle celle è quello di mantenerle in azoto liquido, a circa -180°C. Le cellule sono immagazzinate con un crioconservante, tipicamente DMSO, che aiuta a ridurre la formazione di cristalli dannosi, che possono distruggere le membrane cellulari. Se adeguatamente conservate e conservate, le cellule possono essere rianimate e utilizzate con successo nei saggi decenni dopo.

L'OPZIONE DI MEMORIZZAZIONE AMBIENTALE

Sebbene la conservazione ambientale del DNA e dell'RNA sia attualmente possibile, la conservazione delle cellule a temperatura ambiente è un problema molto più impegnativo. Sebbene non vi sia una tecnologia disponibile per lo stoccaggio a lungo termine di cellule vitali, ci sono stati alcuni progressi con lo stoccaggio a breve termine. Poiché i tempi di fattibilità di queste tecniche sono relativamente brevi, l'attenzione si concentra attualmente sul trasporto ambientale delle colture cellulari. In genere, le cellule sono raccolte o coltivate, poi incorporate in una qualche forma di matrice gelatinosa. Alcune strategie riguardano miscele di zuccheri (Stefansson, Adams et al. 2016; Stefansson, Han et al. 2017), idrogel di alginato (Stefansson, Han et al. 2017) o strutture mucinose (Canton, Warren et al. 2016). Nonostante il fatto che lo stoccaggio ambientale a lungo termine di cellule vitali non sarà disponibile per molto tempo, se non addirittura per molto tempo, oggi esistono soluzioni per lo stoccaggio del DNA e dell'RNA

CONCLUSIONE

Noi di Fisher BioServices comprendiamo le diverse esigenze dei nostri clienti e siamo in grado di soddisfarle attraverso la nostra capacità di gestire il materiale a temperature che vanno da quelle ambientali a quelle criogeniche. I nostri team di esperti hanno una profonda conoscenza della complessa logistica necessaria per spostare i campioni da un sito all'altro, conservarli correttamente per mantenerne l'integrità e gestire un inventario per garantire che tutti i campioni siano prontamente disponibili per le prove. Riconosciamo che l'integrità del campione è essenziale per la ricerca dei nostri clienti e sviluppiamo soluzioni flessibili in modo che siano in grado di raggiungere i loro obiettivi a valle. Ad esempio, la AstraZeneca UK Biobank offre la conservazione a lungo termine e l'accesso rapido a circa 1 milione di campioni biologici umani provenienti da studi clinici, collaboratori e fonti commerciali di AZ Oncology.