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Le guide ottimizzate del sistema CRISPR possono mirare all'RNA, incluso il Coronavirus RNA
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Una volta oscurati dai sistemi CRISPR che mirano al DNA, i sistemi CRISPR che mirano all'RNA stanno facendo un passo verso la luce.
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Inoltre, i sistemi RNA-targeting CRISPR stanno progredendo su importanti applicazioni per le quali sono particolarmente adatti. Per esempio, possono silenziare l'espressione genica a livello trascrizionale, il che è vantaggioso se i corrispondenti target a livello genomico sono di difficile accesso. Inoltre, i sistemi CRISPR che puntano all'RNA possono essere efficaci nel puntare i virus RNA come i coronavirus o i virus dell'influenza.
Per migliorare il targeting di un sistema RNA-targeting CRISPR, gli scienziati del New York Genome Center e della New York University (NYU) hanno elaborato le regole per la progettazione dell'RNA guida del sistema. Questo sistema si basa su un enzima chiamato Cas13, che si complessa con l'RNA guida, che si lega all'RNA messaggero complementare. Migliore è la corrispondenza tra l'RNA guida e l'RNA messaggero, più efficace è l'azione di silenziamento del gene Cas13.
Gli scienziati, guidati da Neville Sanjana, PhD, professore assistente, dipartimento di neuroscienze e fisiologia, NYU, hanno progettato una piattaforma per la conduzione di schermi genetici massicciamente paralleli a livello di RNA nelle cellule umane. Secondo gli scienziati, la tecnologia di screening può essere utilizzata per comprendere molti aspetti della regolazione dell'RNA e per identificare la funzione degli RNA non codificanti, che sono molecole di RNA che vengono prodotte ma non codificano per le proteine.
I dettagli del lavoro degli scienziati sono apparsi il 16 marzo su Nature Biotechnology, in un articolo intitolato "Massively parallel Cas13 screens reveal principles for guide RNA design" L'articolo descrive come gli scienziati hanno usato gli schermi per mirare agli RNA messaggeri di una proteina verde fluorescente transgenica e alle proteine cellulari CD46, CD55 e CD71 nelle cellule umane. In totale, gli scienziati hanno misurato l'attività di 24.460 RNA guida con e senza disallineamenti rispetto alle sequenze target.
"L'efficacia del Knockdown è guidata da caratteristiche specifiche del gRNA e dal contesto del sito target", hanno scritto gli autori dell'articolo. "I singoli disallineamenti riducono generalmente il knockdown ad un modesto grado, ma i nucleotidi spaziatori 15-21 sono in gran parte intolleranti ai disallineamenti del sito target"
Prendendo di mira migliaia di siti diversi nelle trascrizioni degli RNA umani, i ricercatori hanno sviluppato un modello predittivo basato sull'apprendimento automatico per accelerare l'identificazione degli RNA guida Cas13 più efficaci. La nuova tecnologia è disponibile per i ricercatori attraverso un sito web interattivo e un toolbox open-source per prevedere l'efficienza degli RNA guida per i target RNA personalizzati e fornisce RNA guida predefiniti per tutti i geni che codificano le proteine umane.
"Prevediamo che gli enzimi RNA-targeting Cas13 avranno un grande impatto sulla biologia molecolare e sulle applicazioni mediche, ma si sa ancora poco sulla progettazione di RNA guida per un'elevata efficacia di targeting", ha detto Sanjana, autore senior dello studio attuale. "Ci apprestiamo a cambiare questa situazione attraverso uno studio approfondito e sistematico per sviluppare i principi chiave e la modellazione predittiva per una progettazione della guida più efficace"
Gli enzimi Cas13 sono enzimi di tipo VI CRISPR (raggruppati in cluster regolarmente interspaziati con brevi ripetizioni palindromiche) che sono stati recentemente identificati come proteine programmabili RNA-guidate, RNA-targeting con attività della nucleasi che permette di abbattere il gene target senza alterare il genoma. Questa proprietà rende Cas13 un potenziale terapeutico significativo per influenzare l'espressione genica senza alterare permanentemente la sequenza genomica.
Lo scienziato post-dottorato Hans-Hermann Wessels e il dottorando Alejandro Méndez-Mancilla, che sono i primi autori dello studio, hanno sviluppato una suite di nuovi strumenti basati su Cas13 e hanno condotto una trascrizione di piastrelle e uno schermo di permutazione in cellule di mammiferi.
"Abbiamo piastrellato la guida degli RNA attraverso molte trascrizioni diverse, compresi diversi geni umani, dove potevamo facilmente misurare il knock-down delle trascrizioni attraverso la colorazione degli anticorpi e la citometria a flusso", ha detto Wessels. "Lungo il percorso, abbiamo scoperto alcune interessanti intuizioni biologiche che possono espandere l'applicazione degli enzimi Cas13 che mirano all'RNA"
Tra i risultati del team, per esempio, ci sono intuizioni su quali regioni della guida RNA sono più importanti per il riconoscimento di un RNA target. Utilizzando migliaia di RNA guida con una, due o tre lettere non corrispondenti al loro RNA target, hanno identificato una regione "seme" critica che è squisitamente sensibile alle discrepanze tra la guida CRISPR e il target.
Questa scoperta aiuterà gli scienziati nella progettazione di RNA guida per evitare attività off-target su RNA target indesiderati. Dal momento che una cellula umana tipica esprime circa 100.000 RNA, l'accurata individuazione del Cas13 del solo target previsto è vitale per lo screening e le applicazioni terapeutiche.
Oltre a favorire la nostra comprensione del Cas13 fuori dagli obiettivi, la regione "seme" potrebbe essere utilizzata per i biosensori di prossima generazione che possono discriminare più precisamente tra le specie di RNA strettamente correlate. In totale, questo studio aumenta di oltre due ordini di grandezza il numero di punti di dati di precedenti studi Cas13 su cellule di mammiferi.
"Siamo particolarmente entusiasti di utilizzare il sistema di screening ottimizzato Cas13 per mirare a RNA non codificanti", ha detto Méndez-Mancilla. "Questo espande notevolmente la cassetta degli attrezzi CRISPR per gli schermi genetici e trascriptomici in avanti"
Nello studio, i ricercatori hanno notato una marcata differenza nel knockdown proteico quando si mira a diversi elementi di codifica proteica e non codifica di RNA messaggero, e hanno trovato la prova che Cas13 è in concorrenza con altre proteine che legano l'RNA coinvolti nell'elaborazione di trascrizioni e splicing.
Il team ha recentemente fatto leva sul modello predittivo RNA guida per un'analisi particolarmente critica: L'emergenza sanitaria pubblica COVID-19 è dovuta a un coronavirus, che contiene un RNA-non DNA-genoma. Utilizzando il modello derivato dai loro schermi massicciamente paralleli, i ricercatori hanno identificato gli RNA guida ottimali che potrebbero essere utilizzati per la rilevazione futura e le applicazioni terapeutiche. Le previsioni per gli RNA guida Cas13 per un ceppo di SARS-CoV-2 isolato a New York sono state rese disponibili online (http://bit.ly/coronavirus-guides).