SARS-CoV-2 RapidPlex: una piattaforma di telemedicina multipla a base di grafene per la diagnosi e il monitoraggio rapido e a basso costo di COVID-19 by California Institute of TechnologyMedicalExpo

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Rileva la proteina nucleocapside dell'antigene virale, gli anticorpi IgM e IgG, così come la proteina C-reattiva del biomarcatore infiammatorio, basata sui nostri elettrodi di grafene incisi al laser e riproducibili in massa. Dimostriamo una rilevazione elettrochimica ultrasensibile, altamente selettiva e rapida nelle gamme fisiologicamente rilevanti. Abbiamo valutato con successo l'applicabilità della nostra piattaforma SARS-CoV-2 RapidPlex con campioni di sangue e saliva COVID-19-positivi e COVID-19-negativi. Sulla base di questo studio pilota, la nostra piattaforma di immunosensori multipli può consentire di effettuare test ad alta frequenza a casa per la diagnosi e il monitoraggio della telemedicina COVID-19.

L'11 marzo 2020 l'Organizzazione Mondiale della Sanità ha definito l'epidemia COVID-19 una pandemia. Sei mesi dopo, la crisi sanitaria globale è proseguita con oltre 30 milioni di casi confermati di nuovi coronavirus a livello globale, di cui oltre il 22% negli Stati Uniti.1 Si stima che il 14%-20% dei pazienti svilupperà una malattia grave che richiederà il ricovero in ospedale.2 I primi sforzi per mitigare la diffusione attraverso ordini di "stay-at-home" imposti dallo Stato sono sembrati efficaci; tuttavia, la riapertura dell'economia degli Stati Uniti ha portato a una nuova diffusione esponenziale dei nuovi coronavirus, come previsto.3 Si stima che il prodotto interno lordo degli Stati Uniti subirà perdite per 45,3 miliardi di dollari durante una pandemia influenzale senza vaccini disponibili.4 La riapertura sicura dell'economia, delle scuole e delle università richiede molteplici approcci per mitigare i rischi associati al COVID-19, comprese semplici, economiche ed efficaci misure di test-and-trace.

Contenere la diffusione è difficile a causa delle difficoltà nell'identificazione di individui infettivi. La maggior parte della diffusione della comunità COVID-19 può avvenire in assenza di sintomi. Il picco di viremia può essere alla fine del periodo di incubazione, consentendo una carica virale di trasmissione sufficiente 1-2 giorni prima dell'insorgenza dei sintomi.3 Inoltre, a causa della durata e della prevalenza sconosciuta dei casi asintomatici, il numero reale di riproduzione può essere sottovalutato.5 , 6 L'incidenza segnalata di pazienti asintomatici varia dal 17,9% al 30,8%.7 , 8

L'aumento dell'accesso ai test COVID-19 ha permesso un maggiore monitoraggio della diffusione della comunità, ma rimangono diverse sfide diagnostiche. Attualmente, il metodo di test standard è la PCR in tempo reale dell'acido nucleico virale (RT-PCR), che è un processo lento9 e richiede attrezzature costose e tecnici addestrati per la raccolta e l'analisi dei campioni di tampone nasofaringeo.9 Inoltre, il volume di test richiesto è enorme per la capacità dei sistemi sanitari di riferire i risultati della RT-PCR ai pazienti, causando, in alcuni stati, ritardi di ∼7-10 giorni per informare i risultati positivi10 e mettere in atto protocolli di isolamento e monitoraggio. Nonostante i recenti progressi dei test rapidi POC (Point-of-care (POC) per le RT-PCR,11, 12, 13, 14, 15 test dell'acido nucleico sono anche noti per produrre falsi negativi, che possono limitare le strategie di contenimento e l'accesso al trattamento.16 Un'ulteriore considerazione per la RT-PCR è che essa identifica solo i portatori attivi del virus. Identificare le persone convalescenti sulla base della presentazione degli anticorpi COVID-19 è altrettanto importante, in quanto può fornire ai funzionari sanitari informazioni cruciali per quanto riguarda il potenziale impatto delle misure di riapertura.17 I test sierologici rilevano anticorpi in circolazione specifici per gli antigeni SARS-CoV-2, tra cui la proteina nucleocapside e la proteina spike esterna.9 , 18 Tuttavia, non è possibile distinguere tra portatori asintomatici e persone immunitarie che utilizzano la rilevazione degli anticorpi. Pertanto, per mitigare efficacemente i rischi di diffusione della comunità COVID-19, sono necessari sistemi che determinino contemporaneamente lo stato virale e sierologico di un individuo. Inoltre, studi recenti mostrano una correlazione tra la concentrazione di biomarker infiammatori circolanti e la gravità di COVID-19.19 Una maggiore concentrazione di proteina C reattiva (CRP) si trova nei pazienti con diagnosi di polmonite COVID-19 ed è associata ad una crescente gravità, suggerendo un ruolo nella diagnosi e nella prognosi dei pazienti con COVID-19.20 , 21

C'è una chiara e urgente necessità di un test COVID-19 di telemedicina altamente sensibile, rapido, economico, in grado di identificare lo stato di infezione passato e presente di un paziente.22 Ci sono stati progressi verso il test POC COVID-19, ma tutti i kit di test disponibili in commercio forniscono solo risultati qualitativi. L'analisi quantitativa dei biomarcatori COVID-19 che utilizzano un dispositivo di telemedicina può fornire informazioni predittive sulla gravità della malattia e fornire informazioni sulla sieroconversione per quanto riguarda il decorso temporale della malattia. I biosensori elettrochimici, a questo proposito, sono vantaggiosi per la loro rapida efficacia di rilevamento e la facilità d'uso per le applicazioni POC.23, 24, 25, 26, 27 La raccolta di campioni COVID-19 semplice, sicura ed efficace si è dimostrata una sfida, dati i requisiti attuali del test. I saggi POC compatibili con la saliva sarebbero vantaggiosi, poiché la saliva contiene ricche informazioni e può essere raccolta facilmente e non invasivamente dai pazienti stessi per i test di telemedicina.28

Qui, vi presentiamo una nuova piattaforma elettrochimica senza fili, portatile e multiplexata, per il rilevamento ultra-rapido di COVID-19: SARS-CoV-2 RapidPlex (Figura 1). Questa piattaforma rileva quantitativamente biomarcatori specifici per COVID-19 sia nel sangue che nella saliva, tra cui la proteina nucleocapside SARS-CoV-2 (NP), immunoglobuline specifiche (Igs) contro la proteina spike SARS-CoV-2 (S1) (S1-IgM e S1-IgG), e CRP, all'interno di intervalli fisiologicamente rilevanti. La piattaforma utilizza antigeni di cattura e anticorpi immobilizzati su grafene (LEG)29 , 30 elettrodi di grafene (LEG)29 , a basso costo, inciso al laser. Questa piattaforma multiplexata traccia la progressione dell'infezione diagnosticando lo stadio della malattia, permettendo di identificare chiaramente gli individui che sono infettivi, vulnerabili e/o immuni (Tabella 1). Le caratteristiche principali del RapidPlex SARS-CoV-2 sono l'alta sensibilità, il basso costo, il rilevamento ultraveloce, il telecomando senza fili e il rilevamento multiplexato che fornisce informazioni su tre aspetti chiave della malattia COVID-19: infezione virale (NP),31 risposta immunitaria (IgG e IgM),9 e gravità della malattia (CRP).19, 20, 21

Come illustrato nella Figura 1A, SARS-CoV-2 RapidPlex è composto da quattro elettrodi di lavoro in grafene (WEs), un elettrodo di riferimento Ag/AgCl (RE) e un controelettrodo in grafene (CE), tutti modellati su un substrato di poliimmide (PI) tramite incisione laser a CO2, un metodo di produzione veloce, ad alta produttività ed economico (Figure 1B e 1C). Il nostro gruppo ha recentemente dimostrato l'uso della struttura mesoporosa del grafene realizzata con l'incisione laser per alte prestazioni e biosensing a basso costo.29 , 30 Il costo dei materiali per la piattaforma RapidPlex non modificata è di 0,05 dollari; i costi aggiuntivi di prodotti chimici e reagenti per la preparazione del sensore multiplexato sono a livello di dollari a seconda delle dimensioni dell'ordine. Il rilevamento di proteine target selezionate (NP e CRP) e di immunoglobuline specifiche (S1-IgG e S1-IgM) si ottiene attraverso strategie di immunosensibilità a sandwich e indirette sugli elettrodi LEG, rispettivamente. Le proprietà superiori del grafene, in termini di mobilità ad alta carica e superficie, insieme all'elevata sensibilità e selettività delle strategie di rilevamento che coinvolgono sia i recettori di cattura che quelli del rivelatore, rendono il nostro dispositivo (Figura 1D) uno strumento estremamente comodo per il rilevamento rapido, accurato e specifico per ogni fase dell'infezione COVID-19 nel sangue e nei campioni di biofluidi non invasivi, come la saliva.

Le fasi di funzionalizzazione e modifica effettuate sulle superfici del LEG per il fissaggio covalente di ciascuno dei recettori specifici richiesti per lo sviluppo della nostra piattaforma SARS-CoV-2 RapidPlex sono schematizzate nella Figura 2 A. L'acido 1-Pirenebutirrico (PBA) è utilizzato come linker per ancorare i recettori richiesti allo strato di grafene. Sebbene l'ancoraggio di gruppi funzionali direttamente sulla superficie dell'atomo di carbonio sp2 sia uno dei modi comuni per funzionalizzare il grafene, questi metodi sono associati al requisito di difetti o bordi nel materiale del sensore, che potrebbero alterare le sue proprietà fisiche specifiche.32 , 33 Al contrario, l'introduzione di gruppi funzionali sullo strato sensibile per mezzo di derivati del pirene è qui preferibile, in quanto non disturba la coniugazione dei fogli di grafene e ne migliora la stabilità.34 , 35 PBA costituito da un gruppo di pirene che contiene elettroni π e un gruppo carbossilico è usato per funzionalizzare gli strati di grafene tramite interazioni π-stacking e idrofobiche. Le unità di pirene del PBA interagiscono fortemente con gli strati di grafene nel modo in cui la struttura originale e le proprietà del grafene sono ben mantenute. I motti funzionali contenuti in ogni molecola di PBA permettono la preparazione della piattaforma di biosensing basata sull'affinità attraverso l'accoppiamento covalente tra i gruppi carbossilici sulle unità di PBA e i gruppi -NH2 dei rispettivi recettori di cattura (anticorpi specifici o proteine di cattura). Il blocco dei siti non reagiti con sieroalbumina bovina (BSA) impedisce l'adsorbimento non specifico di altre molecole coinvolte in ogni configurazione di saggio o che circolano nel campione di interesse.

Le tecniche di voltammetria differenziale ad impulsi (DPV) e di spettroscopia di impedenza potenziale elettrochimica a circuito aperto (OCP-EIS) sono impiegate per caratterizzare elettrochimicamente e dimostrare i processi autoassemblati in entrambe le configurazioni di saggio per il rilevamento di molecole target selezionate. Le letture DPV riflettono una minore intensità di corrente di picco dopo ogni fase di modifica relativa al saggio S1-Ig a causa della diffusione ostacolata dell'etichetta redox sulla superficie dell'elettrodo derivata sia dai gruppi carbossilici che dalle proteine e dalle macromolecole biologiche collegate (Figura 2B). Allo stesso tempo, la resistenza nelle trame di Nyquist da OCP-EIS è aumentata dopo ogni fase di funzionalizzazione (Figura 2C). Il successo dell'ancoraggio del PBA è stato verificato anche con la microscopia elettronica a scansione (SEM) (Figura S1). La caratterizzazione elettrochimica della modifica del sensore basato sul saggio a sandwich utilizzando CRP come molecola modello e le tecniche di cui sopra sono presentate nella Figura S2.

Per preservare la struttura nativa e le proprietà delle biomolecole legate, abbiamo scelto il PBA come linker eterobifunzionale, impedendo efficacemente l'interazione diretta tra le biomolecole di grandi dimensioni e la superficie del grafene.33 Per verificare questa selezione, abbiamo costruito configurazioni di saggio IgG specifiche per CRP e SARS-CoV-2 su elettrodi di grafene funzionalizzati con PBA e un altro comune linker, l'acido 1H-pirrole-1-propionico (PPA).30 Per entrambi i saggi in cui il PBA è stato utilizzato come supporto del linker (Figura 2D), sono stati osservati rapporti segnale-blank (S/B) maggiori per entrambi i saggi, principalmente a causa di una significativa diminuzione dei segnali ottenuti in assenza della molecola bersaglio corrispondente quando il PBA è stato utilizzato al posto del PPA. Insieme ad una strategia di blocco ottimale, il PBA può essere utilizzato per l'immobilizzazione di specifiche sonde biomolecolari (ad esempio, anticorpi, proteine), evitando al contempo adsorbimenti non specifici nel contesto dei saggi immunologici.36

L'orientamento delle proteine antigeniche modificate sulle superfici solide è fortemente associato alla loro attività e reattività. Specifici anticorpi anti-His possono essere utilizzati per orientare l'immobilizzazione dei recettori antigenici contenenti residui di istidina, ma questo implica un ulteriore passo avanti rispetto al loro attacco diretto sullo strato di rilevamento, come schematizzato nella Figura S3A. I nostri risultati non mostrano differenze significative nelle prestazioni del test per il rilevamento delle IgG su elettrodi PBA-grafene covalentemente funzionalizzati con la specifica proteina di rivestimento (immobilizzazione diretta) e con anticorpi anti-His per la precedente cattura della proteina di rivestimento specifica della polistidina (immobilizzazione orientata) (Figura S3B), dimostrando che l'orientamento casuale della proteina non interferisce con l'accessibilità dell'epitopo per un efficace riconoscimento da parte di specifici anticorpi bersaglio. Questo è in accordo con altri rapporti che confermano che gli antigeni di fusione His-tagged possono essere immobilizzati direttamente su diverse superfici con orientamenti proteici completamente compatibili con il riconoscimento degli anticorpi.37, 38, 39, 40 Per semplificare e ridurre il costo e il tempo del saggio, abbiamo effettuato l'immobilizzazione diretta della proteina S1 per il rilevamento di Ig specifici.

Considerando che il legame rapido dei target è essenziale per il successo dell'implementazione della nostra piattaforma proposta come sistema POC, abbiamo studiato come il tempo di incubazione del target (o del campione) influisce sulla risposta di ogni biosensore che comprende la nostra piattaforma SARS-CoV-2 RapidPlex. La Figura 2E riassume i segnali amperometrici ottenuti per ciascuna delle quattro unità di rilevamento in diversi tempi di incubazione (1, 5 e 10 minuti) in assenza (bianco, B) e presenza (S) di 500 pg mL-1, 250 ng mL-1, e 50 ng mL-1 di NP, SARS-CoV-2 specifici isotipi IgG e IgM, e CRP, rispettivamente. È importante notare che, sebbene per la maggior parte degli studi sia stato selezionato un tempo di incubazione di 10 minuti, al fine di garantire la massima sensibilità per la determinazione dei livelli ultra-bassi di ciascuna molecola target, una differenza significativa tra l'assenza e la presenza di ciascuno dei target corrispondenti si ottiene con un solo tempo di incubazione di 1 minuto. Questo fornisce uno dei principali vantaggi del nostro sistema RapidPlex SARS-CoV-2 come dispositivo POC rapido per il monitoraggio dell'infezione da SARS-CoV-2 con la sensibilità richiesta sia per la determinazione delle proteine che degli Ig. ELISA,17 , 41, 42, 43, 44 amplificazione dell'acido nucleico,45, 46, 47, 48, 49 spettrometria di massa,50 o anche combinazioni51 sono stati segnalati molto recentemente per la determinazione delle molecole target specifiche proposte per la SARS-CoV-2, tra le altre. Tuttavia, la maggior parte di questi metodi mostrano insidie cruciali, soprattutto in termini di preparazione del campione, complessità e requisiti di apparecchiature costose e ingombranti, che li rendono ancora molto difficili da implementare come sistemi POC. Il nostro dispositivo fornisce un'alternativa interessante ai test standard per la determinazione delle proteine, come l'ELISA, grazie alle sue capacità di multiplexing, alla funzionalità remota e al breve tempo di risposta campione per campione.

Le prestazioni di ogni biosensore contenuto nel SARS-CoV-2 RapidPlex sono state caratterizzate in soluzioni saline a tampone fosfato (PBS) integrate con 1,0% di BSA misurando la lettura amperometrica in presenza di maggiori concentrazioni di NP, S1-IgG, S1-IgM e CRP (Figura 3). Le strategie selezionate per l'antigene virale NP e le proteine CRP si basano su configurazioni a doppio sandwich e sandwich, rispettivamente, come illustrato nella Figura 3A. Gli immunodosaggi a sandwich per la rilevazione dell'antigene sono, in generale, altamente sensibili a causa del coinvolgimento di due diversi anticorpi come entità di cattura e rivelatore. In base ai bassi livelli che devono essere raggiunti per NP e CRP nel siero diluito e nella saliva (da pg mL-1 a ng mL-1), riteniamo che queste strategie siano le più adatte ad essere implementate sulla nostra piattaforma. La variazione delle correnti catodiche con la concentrazione per NP e CRP in soluzioni tampone è presentata nelle Figure 3B e 3C, rispettivamente. S1-IgG e S1-IgM sono stati rilevati sulla base di immunodosaggi indiretti (Figura 3D), che sono considerati altamente adatti per il rilevamento di macromolecole circolanti in antisieri e altri biofluidi. Le figure 3E e 3F mostrano le curve di calibrazione per la determinazione di Ig specifici per S1 (S1-IgG e S1-IgM, rispettivamente) in soluzioni tampone. La riproducibilità è stata dimostrata attraverso i valori di deviazione standard relativa (RSD) ottenuti con diversi biosensori preparati nello stesso modo in giorni diversi. Valori RSD del 6,3%, 8,4%, 6,0% e 7,6% per 20 ng mL-1 CRP, 250 ng mL-1 S1-IgG, 250 ng mL-1 S1-IgM e 500 pg mL-1 NP antigene (n = 5) dimostrano una buona riproducibilità sia nella preparazione del dispositivo che nella trasduzione del segnale. Inoltre, i sensori hanno mostrato risposte stabili per un periodo di conservazione di 5 giorni a 4°C (Figura S4). Non abbiamo osservato variazioni significative di pendenza tra i dati ottenuti in siero umano opportunamente diluito e in soluzioni tamponate per la determinazione di ciascun analita bersaglio (ad esempio, il valore di sensibilità di pendenza [16,28 nA mL ng-1] ottenuto per CRP come analita modello in soluzioni tamponate con PBS è quasi lo stesso che in campioni di siero diluito da un volontario sano [16.64 nA mL ng-1]); pertanto, una quantificazione accurata degli analiti bersaglio proposti può essere effettuata effettuando una semplice interpolazione delle letture catodiche ottenute per ogni campione testato nella corrispondente curva di calibrazione costruita in soluzione tamponata.

Poiché la sensibilità diagnostica e la specificità degli studi di sieroprevalenza possono essere migliorate utilizzando una miscela di proteine antigeniche invece di una singola proteina,52 , 53 abbiamo modificato il grafene con una miscela di antigeni correlati alla SARS-CoV-2, NP e S1, per catturare isotipi specifici di immunoglobuline contro entrambi gli antigeni nello stesso WE. Una curva di calibrazione per la rilevazione di (NP + S1)-IgG è mostrata nella Figura S5. Pertanto, questa metodologia può essere personalizzata per il rilevamento di IgG specifiche per isotipo (o IgM) o una combinazione di entrambi gli isotipi Ig nella stessa superficie di rilevamento per catturare meglio la concentrazione totale di Ig e quindi aumentare la sensibilità del test in tutta la popolazione di pazienti.

I biofluidi umani contengono una miscela complessa e variabile di molecole circolanti che potrebbero interferire con il rilevamento molecolare. Inoltre, la diafonia trascurabile tra le diverse superfici di lavoro è un requisito essenziale per eseguire letture di rilevamento multiplexate in modo accurato e significativo. Pertanto, sono state valutate la selettività e la diafonia della piattaforma SARS-CoV-2 RapidPlex. Le letture amperometriche ottenute per ogni biosensore sviluppato contro molecole non bersaglio sono presentate nella Figura 4 A. Abbiamo valutato il legame specifico per i biomarcatori della SARS-CoV-2 rispetto ai biomarcatori di coronavirus simili, tra cui SARS-CoV e MERS-CoV. Non abbiamo osservato alcuna reazione crociata significativa per i test NP, S1-IgG, S1-IgM e CRP in presenza di ciascun interferente testato, compresi SARS-CoV-2 S1, SARS-CoV S1 e CRP (per il test NP), SARS-CoV-2 NP-IgG, SARS-CoV IgG, MERS-CoV IgG, S1-IgG, e controlli negativi contenenti miscele di IgG e IgM contro MERS-CoV e SARS-CoV (per i saggi S1-IgG e S1-IgM), e peptide natriuretico di tipo B (BNP), NP, SARS-CoV NP, e SARS-CoV S1 (per il saggio CRP), rispettivamente. Tuttavia, l'interferente dell'antigene virale SARS-CoV NP ha fornito una corrente catodica corrispondente al 5% della corrente grezza ottenuta per il rilevamento dell'antigene specifico NP. Le proteine della SARS-CoV-2 condividono il 76%-95% dell'identità della sequenza con quelle della SARS-CoV. Questa omologia percentuale è ridotta al 30%-40% per MERS-CoV. Allo stesso modo, poiché la SARS-CoV-2 NP è identica al 90% a quella della SARS-CoV NP,17 , 54, 55, 56 l'interferenza osservata dall'antigene SARS-CoV NP era prevista. Tuttavia, la mancanza di selettività in questo caso particolare non è una preoccupazione importante a causa dell'assenza di nuovi casi di SARS-CoV rilevati di recente; pertanto, si può dedurre che questa interferenza non produrrà una barriera per la determinazione selettiva della SARS-CoV-2 NP nei campioni reali. Abbiamo inoltre valutato le concentrazioni derivate dall'amperometria con concentrazioni derivate dall'assorbanza raccolte tramite ELISA. Come presentato in Figura 4B, i risultati del nostro biosensore elettrochimico funzionalizzato sono stati linearmente correlati (r = 0,955) con i risultati utilizzando gli stessi reagenti in un protocollo ELISA tradizionale.

Una volta che le prestazioni e la selettività di ogni biosensore costruito sono state valutate in modo individuale ed esaustivo, dimostriamo le capacità di multiplexing del nostro dispositivo ad array di grafene a quattro elettrodi funzionanti (4WE) progettato con un Ag/AgCl RE e un CE di grafene. Il diagramma a blocchi che mostra le unità funzionali che costituiscono il sistema elettronico integrato è illustrato nelle Figure 4C e 4D. Le letture amperometriche dei quattro canali vengono rilevate contemporaneamente e i dati vengono trasmessi senza fili ad un dispositivo utente via Bluetooth. Il sistema elettronico, che comprende il circuito stampato (PCB) e una batteria agli ioni di litio polimeri, ha dimensioni di 20 × 35 × 7,3 mm. Il dispositivo compatto è in grado di eseguire misurazioni amperometriche in continuo per oltre 5 ore con una singola carica.

Con l'obiettivo di dimostrare l'utilità del nostro array RapidPlex SARS-CoV-2 per la quantificazione multiplexata e simultanea di molecole target selezionate, abbiamo valutato la potenziale reazione incrociata risultante dalla diffusione di sostanze di segnale tra le immunosuperfici adiacenti. A tal fine, ciascuna delle quattro superfici di lavoro convenientemente funzionalizzate sono state incubate con soluzioni tampone contenenti una concentrazione significativamente elevata di ciascuno dei bersagli selezionati, seguite dai corrispondenti recettori del rivelatore in ciascun caso. L'assenza di diafonia tra i WE adiacenti è verificata dalle letture sperimentali in soluzioni tampone contenenti 1,0 ng mL-1 NP antigene (I), 250 ng mL-1 S1 specifico IgG (II) e IgM (III), e 50 ng mL-1 CRP (IV) (Figura 4E). Come previsto, segnale significativamente più alto è stato ottenuto quando ogni bersaglio è stato specificamente catturato e ulteriormente etichettato dal suo anticorpo tracciante nel corrispondente immunosuperficie funzionalizzata. Questi risultati, in combinazione con quelli della Figura 4A, dimostrano la fattibilità della piattaforma sviluppata SARS-CoV-2 RapidPlex per la determinazione rapida, selettiva e affidabile di NP, S1-IgG, e S1-IgM isotipi, e CRP in un unico esperimento. Va notato che, poiché IgG e IgM hanno meccanismi di legame simili agli antigeni virali e la quantificazione individuale delle immunoglobuline non richiede la miscelazione delle specifiche etichette del rivelatore, le singole goccioline sono state utilizzate su elettrodi di rilevamento IgG e IgM durante la modifica e l'etichettatura.

Per dimostrare l'utilità del nostro dispositivo in uno scenario più complesso e reale, abbiamo valutato le capacità multiplexate del SARS-CoV-2 RapidPlex in campioni di siero rappresentativi di soggetti COVID-19 RT-PCR-negativi e -positivi. I dati dei sensori provenienti dai campioni di siero di un soggetto RT-PCR-negativo (Figura 5 A) e di un paziente RT-PCR-positivo (Figura 5B) mostrano una diafonia minima in una matrice campione reale e complessa, indicando l'efficiente funzionalità del SARS-CoV-2 RapidPlex per differenziare simultaneamente la presenza sovraespressa dei target reporter correlati al SARS-CoV-2 nei campioni COVID-19-positivi. Inoltre, il dispositivo SARS-CoV-2 RapidPlex è in grado di fornire letture positive significative per tutti i target dopo l'incubazione del campione di siero COVID-19 positivo per solo 1 minuto (Figure 5C e S6): Il mantenimento di un segnale elevato nei campioni positivi dei pazienti dimostra il grande potenziale nella futura traduzione del dispositivo SARS-CoV-2 RapidPlex come strumento di diagnostica remota POC ultra-veloce.

Per indagare ulteriormente la risposta di NP, S1-IgG, S1-IgM e CRP all'infezione da SARS-CoV-2 utilizzando i nostri biosensori a base di LEG, abbiamo misurato ogni molecola target in campioni di siero e saliva provenienti da soggetti RT-PCR-confermato COVID-19 positivi e -negativi. I risultati ottenuti sono stati tracciati come rapporto tra le letture amperometriche per ogni campione testato (S) e il rispettivo bianco (B) in ogni caso per confrontare il rilevamento del target in diversi intervalli di concentrazione. Utilizzando i sensori di grafene, sono stati analizzati un totale di 17 campioni di siero COVID-19 RT-PCR-testato (10 positivi, 7 negativi) e un totale di 8 campioni di saliva COVID-19 RT-PCR-testato (5 positivi, 3 negativi) sono stati analizzati (Tabella S1).

I risultati delle Figure 5D e 5E confermano che, come previsto, rispetto ai soggetti RT-PCR-negativi, i pazienti RT-PCR-positivi COVID-19 mostrano livelli significativamente elevati dei target selezionati sia nel siero che nei campioni di saliva, con rapporti mediani S/B di 10,53, 11,62, 10,67 e 12,39 nel siero e 2,81, 3,24, 1,62 e 1,76 nella saliva, rispettivamente per NP, S1-IgG, S1-IgM e CRP. Abbiamo osservato una concentrazione di NP nell'intervallo 0,1-0,8 μg mL-1 e 0,5-2,0 ng mL-1 nel siero del paziente COVID-19 e nella saliva, rispettivamente; S1-IgG nell'intervallo 20-40 μg mL-1 e 0,2-0.5 μg mL-1 nel siero paziente COVID-19 e saliva, rispettivamente; S1-IgM nell'intervallo 20-50 μg mL-1 e 0,6-5,0 μg mL-1 nel siero paziente COVID-19 e saliva, rispettivamente; e CRP nell'intervallo 10-20 μg mL-1 e 0,1-0,5 μg mL-1 nel siero paziente COVID-19 e saliva, rispettivamente. Il fatto che tutti i campioni positivi mostrino segnali molto più elevati rispetto ai campioni negativi dimostra la reale utilità per la valutazione accurata dei biomarcatori COVID-19 nei biofluidi utilizzando i nostri biosensori a base di LEG. In particolare, la presenza significativa osservata di biomarcatori COVID-19 nella saliva dimostra l'eccezionale utilità di questo biofluido come fonte preziosa per la diagnosi e il monitoraggio non invasivo dell'infezione da SARS-CoV-2.

Con l'obiettivo di confermare la relazione tra i livelli dei biomarcatori infiammatori coinvolti nella tempesta di citochine direttamente associati alla progressione, alla gravità e all'esito della malattia in COVID-19,57, 58, 59, 60, 61, 62 abbiamo valutato la variazione dei livelli sierici di CRP nei soggetti RT-PCR-negativi (n = 7) e nei pazienti RT-PCR-positivi COVID-19 che sono stati classificati clinicamente secondo la gravità della malattia come asintomatici (n = 2), lievi (n = 5) e moderati (n = 2). Come mostrato nella Figura 5F, abbiamo osservato un'associazione positiva tra la concentrazione di CRP e il grado di gravità del sintomo COVID-19, coerente con i recenti rapporti della letteratura.20 , 61 Per determinare la relazione tra le concentrazioni di saliva e siero e per convalidare l'utilità della nostra piattaforma nell'identificare la gravità specifica di COVID-19 (Tabella 1) sono necessari futuri test clinici che utilizzino campioni di saliva e siero accoppiati nel corso dell'infezione.

Per rispondere alle crescenti richieste di strumenti diagnostici efficaci per la semplice rilevazione di COVID-19 con un'immediata risposta campione per risposta, abbiamo sviluppato e implementato la prima piattaforma elettrochimica multiplexata basata su grafene, SARS-CoV-2 RapidPlex, per l'interrogazione simultanea sensibile, rapida e selettiva dell'antigene virale NP, degli isotipi S1-IgG e S1-IgM e CRP nei biofluidi sierici e saliva di pazienti sani e con infezione da COVID-19 confermata dalla RT-PCR. La combinazione delle vantaggiose proprietà del materiale grafene con l'elevata sensibilità e specificità delle strategie di immunosensibilità rende la nostra piattaforma SARS-CoV-2 RapidPlex un promettente dispositivo diagnostico per il monitoraggio accurato dell'infezione da COVID-19 nel siero e nei fluidi corporei non invasivi esenti da complessi requisiti di pretrattamento del campione. Grazie alla facilità d'uso, alla compatibilità del campione di saliva e alla rapidità dei risultati, la piattaforma SARS-CoV-2 RapidPlex ha un elevato potenziale di implementazione presso il POC per il triage del paziente, così come per l'utilizzo a domicilio per la cura in telemedicina e il monitoraggio remoto.

Il monitoraggio dei bersagli selezionati in un unico e veloce esperimento (la cattura del bersaglio può durare anche solo 1 minuto) fornisce informazioni sostanziali, non solo per quanto riguarda l'infezione precoce da COVID-19 attraverso la rilevazione dell'antigene virale e dell'isotipo IgM, ma anche sulla gravità della malattia attraverso la valutazione CRP e la potenziale immunità acquisita attraverso la quantificazione dell'isotipo IgG. La rapida valutazione in loco della gravità della malattia consentita dal nostro SARS-CoV-2 RapidPlex introduce l'ineguagliabile vantaggio del triage immediato COVID-19. Nelle future applicazioni cliniche, questo potrebbe non solo allertare i medici curanti dei casi che richiedono un'attenzione medica importante e attenta, ma anche facilitare l'allocazione efficiente di preziose risorse mediche, come ventilatori e letti di terapia intensiva, in caso di ricomparsa di epidemie, per ottimizzare gli esiti dei pazienti in un sovraccarico dei sistemi sanitari locali.

Le metodologie da noi proposte, basate su tecniche di funzionalizzazione delle superfici semplici ma ben consolidate e su principi di rilevamento, consentono la facilità di traduzione verso l'individuazione di altri reporter altamente informativi relativi alla SARS-CoV-2, semplicemente cambiando il recettore di cattura del rivestimento. Un ulteriore miglioramento tecnologico potrebbe essere ottenuto introducendo un processo di gestione del campione completamente automatizzato attraverso un modulo microfluidico per la diffusione della telemedicina. La modifica del design della nostra piattaforma può consentire un rapido panel test dell'antigene virale e degli anticorpi in modo da distinguere chiaramente l'infezione da COVID-19 dai sintomi non specifici delle infezioni respiratorie stagionali come l'influenza. Inoltre, la piattaforma diagnostica di telemedicina senza fili, se abbinata a biosensori indossabili emergenti per il monitoraggio continuo dei segni vitali e di altri biomarcatori chimici, potrebbe fornire informazioni complete sullo stato di salute di un individuo durante la pandemia COVID-19.63, 64, 65, 66, 67

La nostra piattaforma è all'avanguardia nella rilevazione multiplexata di biomarcatori specifici per la SARS-CoV-2 per fornire un'istantanea dettagliata e personalizzata dell'infezione COVID-19. Crediamo fermamente che la nostra piattaforma sviluppata sarà un metodo di test ad alta utilità per combattere questa e le future pandemie, contribuendo a porre fine a una delle crisi sanitarie, economiche e umanitarie globali più profonde della storia moderna.