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Imaging cerebrale a super-risoluzione

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La luce - e tutte le onde - possono piegarsi intorno agli angoli degli ostacoli che si trovano lungo il suo percorso. A causa di questo fenomeno, chiamato diffrazione, è impossibile mettere a fuoco la luce in un punto che sia più piccolo della metà della sua lunghezza d'onda. In altre parole, la più alta risoluzione che si può teoricamente raggiungere usando un microscopio ottico è di circa 250 nm, una barriera chiamata limite di diffrazione. Sfortunatamente, questa risoluzione non è sufficiente per osservare strutture cellulari fini, come quelle che si trovano nei neuroni.

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Per più di un secolo, i microscopisti sono stati ostacolati da questa classica barriera fino all'invenzione della microscopia a fluorescenza a super-risoluzione. Un approccio particolarmente potente è stato sviluppato alla fine degli anni '90 e coniato come microscopia ad emissione stimolata (STED). Questa tecnica richiede che il campione di destinazione contenga fluorofori, che sono composti che assorbono la luce a una lunghezza d'onda e poi la riemettono a una lunghezza d'onda maggiore. Nella versione più semplice della microscopia STED, i fluorofori sono eccitati in un punto circolare per irradiazione con un laser focalizzato limitato alla diffrazione. Poi, una porzione a forma di ciambella intorno allo spot viene irradiata con luce meno energetica - il raggio di esaurimento - che spegne la fluorescenza attraverso il processo di emissione stimolata. Così, l'effetto netto è che solo i fluorofori nel centro della ciambella riemettono fotoni, e perché quell'area può essere fatta arbitrariamente piccola, questo permette la microscopia di super-risoluzione.

Anche se la microscopia STED è stata una vera svolta per l'osservazione della morfologia dei neuroni dal vivo ad alta risoluzione, c'è ancora spazio per il miglioramento. In un recente studio pubblicato su Neurophotonics, un team di scienziati guidati dal Dr. U. Valentin Nägerl dell'Université de Bordeaux ha sviluppato un metodo di calibrazione semplice ma efficace che permette un imaging STED più preciso a profondità maggiori di tessuto. Il loro approccio si basa sull'analisi e la correzione di una delle principali fonti di errore sistematico nella microscopia STED per i campioni biologici: l'aberrazione sferica del fascio di deplezione.

Quando l'imaging di un campione di tessuto a profondità superiori a 40 μm, il fascio di deplezione subisce vari tipi di defocalizzazione e degradazione (aberrazione) e perde la sua forma accuratamente realizzato, che è essenziale per il metodo STED. L'aberrazione sferica è il più grande colpevole ed è stato il bersaglio dei ricercatori. La loro strategia è stata quella di preparare prima un campione di tessuto cerebrale fantasma, una procura a base di gel con un indice di rifrazione simile a quello del cervello reale. Questo campione fantasma conteneva fluorofori omogeneamente dispersi e nanoparticelle d'oro, che hanno permesso al team di visualizzare chiaramente e quantificare come la forma del fascio di deplezione si distorceva man mano che penetrava più in profondità. Poi, hanno calcolato le necessarie pre-regolazioni che dovrebbero essere fatte al fascio di deplezione in base alla profondità del tessuto in modo che la sua forma finale corrisponda più da vicino a quella ideale. Le regolazioni sono state fatte usando l'ottica adattiva, che è una tecnologia originariamente sviluppata dagli astronomi per migliorare le immagini telescopiche che soffrono di aberrazioni causate dall'atmosfera terrestre.

Una volta che la forma del fascio di deplezione era stata calibrata secondo i test del fantasma, gli scienziati hanno proceduto all'immagine del tessuto neurale dal vivo. Hanno confrontato i risultati della microscopia STED regolare, della microscopia STED corretta e della microscopia a due fotoni - una tecnica che è specificamente regolata per l'imaging dei tessuti profondi. I risultati sono stati abbastanza convincenti: le immagini STED corrette hanno catturato i dettagli fini dei dendriti neurali più profondi molto meglio delle immagini STED standard. "Usando la nostra strategia di calibrazione, abbiamo potuto misurare strutture neuronali piccole come 80 nm a una profondità di 90 μm all'interno del tessuto biologico e ottenere un aumento del segnale del 60 per cento dopo la correzione dell'aberrazione sferica", dice Nägerl.

Ji Yi, professore di ingegneria biomedica alla Johns Hopkins University osserva: "La microscopia a super-risoluzione è stata applicata principalmente per campioni sottili, come le cellule a strato singolo, dove la dispersione della luce è trascurabile. Il team guidato da Valentin Nägerl ha implementato l'ottica adattiva in una microscopia a due fotoni ad emissione stimolata (2P-STED), e ha raggiunto una risoluzione di 80 nm nell'imaging delle spine dendritiche dei neuroni attraverso 90 micron di tessuto cerebrale. Questo è degno di nota perché la super-risoluzione è difficile da mantenere in un tessuto più spesso - in particolare data la qualità altamente diffusiva del tessuto cerebrale" Yi spiega che il progresso faciliterà lo studio delle attività e delle interazioni neurali.

Considerando che questo nuovo processo di calibrazione è robusto, semplice da implementare e relativamente poco costoso, potrebbe essere facilmente incorporato nelle pratiche di laboratorio standard per ottenere risultati migliori con i microscopi STED, a condizione che il campione fantasma preparato corrisponda alle proprietà ottiche del campione biologico. A questo proposito, Nägerl afferma: "Il nostro approccio non è limitato ai campioni di cervello; potrebbe essere adattato ad altri tessuti con indici di rifrazione noti e relativamente omogenei, così come ad altri tipi di preparazioni, anche potenzialmente nel cervello di topo intatto e vivo"