Tre motivi per abbandonare le linee cellulari continue

Nel 1665 Robert Hooke, uno scienziato britannico, scoprì e diede un nome alle cellule.

Successivamente, i biologi tedeschi Matthias Jakob Schleiden e Theodor Schwann proposero la teoria cellulare, dando a tutti una comprensione più chiara della cellula, un'unità relativamente indipendente che costituisce la nostra vita.

Per comprendere meglio l'essenza della vita e svelare le leggi delle attività vitali delle cellule, gli scienziati hanno condotto una serie di ricerche sulla proliferazione, il movimento, il metabolismo, la morte e altre attività cellulari. In realtà, già nel XIX secolo alcuni hanno proposto il concetto di separare le cellule viventi dai tessuti, ma la coltura delle cellule animali è stata studiata solo nel 1950. Dalla semplice osservazione dello sviluppo cellulare, all'isolamento delle cellule primarie dai tessuti, fino all'ottenimento di linee cellulari continue che possono essere sottoposte a un passagio continuo. La trasformazione delle cellule da concetto illusorio a materiale sperimentale indispensabile per gli esperimenti di ricerca in vitro ha attraversato l'intera storia dello sviluppo biologico. Le cellule utilizzate per la ricerca scientifica si dividono principalmente in due tipi: cellule primarie isolate direttamente dai tessuti e linee cellulari acquistate.

Di solito, le cellule dal primo al decimo passaggio isolate dal tessuto sono indicate collettivamente come cellule primarie; la maggior parte delle cellule primarie ristagna gradualmente, senescono e muoiono dopo questo passaggio, e un numero molto piccolo di cellule può sopravvivere fino alla cinquantesima generazione. Dopo cinquanta generazioni, le informazioni genetiche delle cellule sono cambiate e sono diventate una linea cellulare continua. Alcune cellule hanno perso l'inibizione da contatto, possono crescere in più strati e possono persino causare tumori dopo l'inoculazione allogenica

Le linee cellulari continue sono sempre state la prima scelta per gli studi a livello cellulare grazie alla loro immortalità e alla rapida divisione. Inoltre, hanno le caratteristiche di una coltura conveniente, di un'ampia varietà, di un rapido tasso di crescita, di un basso costo e di una ricerca rapida, il che rende varie linee cellulari continue ampiamente utilizzate. Ad esempio, le cellule Hela, la prima linea cellulare umana che può essere sottoposta a un ciclo continuo, aiutano gli scienziati a concentrarsi in modo più efficiente sulle malattie delle cellule umane e sul meccanismo d'azione dei farmaci attivi e sono ampiamente utilizzate in oncologia, immunologia, virologia e altre discipline.

Negli ultimi anni, gli studi hanno scoperto che, sebbene le linee cellulari continue siano ricche di tesori, vi sono ancora alcune limitazioni nella loro applicazione.

Limitazione 1: la biologia della cellula è alterata

Durante il processo di ricerca, spesso è necessario un gran numero di campioni, per cui è necessaria una rapida propagazione ed espansione delle linee cellulari continue. Inoltre, il processo di passaging continuo è soggetto a mutazioni, il passaggio illimitato può portare a cambiamenti nel genotipo e nel fenotipo della linea cellulare, influenzando così i risultati sperimentali. Allo stesso tempo, le caratteristiche biologiche delle linee cellulari immortalizzate e delle cellule viventi sono molto diverse e non possono rappresentare pienamente l'ambiente reale degli animali. Le cellule primarie sono considerate più rappresentative della situazione tissutale in vivo e sono state legalmente riconosciute in alcuni Paesi/regioni (Human Tissue Act 2004, Regno Unito), in particolare nei test di valutazione della tossicità precoce dei farmaci, rispetto alle linee cellulari, l'uso di cellule primarie isolate direttamente dal tessuto del paziente è più appropriato.

Limitazione 2: contaminazione incrociata delle linee cellulari

Quando si parla di contaminazione cellulare, la prima reazione di tutti è che i microrganismi patogeni causano il fallimento degli esperimenti cellulari. Tuttavia, non si tratta di dire che la proliferazione batterica nel sistema di coltura influisce sull'esperimento, ma della contaminazione incrociata tra linee cellulari, ovvero che le linee cellulari utilizzate per l'esperimento possono essere mescolate con altri tipi di cellule. Questo problema può essere causato quando la linea cellulare viene stabilita, oppure può essere causato da alcune operazioni improprie, come la co-coltura di più cellule allo stesso tempo, il riutilizzo di materiali di consumo o causato da prodotti di coltura cellulare correlati. Ogni operazione involontaria può portare al fallimento dell'intero esperimento

Nel 2011 gli Stati Uniti hanno emanato uno standard nazionale per l'identificazione delle STR cellulari. Sebbene molti ricercatori non siano ancora consapevoli della gravità del problema, le istituzioni competenti hanno iniziato a lanciare l'allarme:

Sia nel numero di dicembre 2014 che in quello di febbraio 2015 della rivista Science sono stati pubblicati articoli che spiegano la gravità della contaminazione incrociata e dell'errata identificazione delle cellule, evidenziando le conseguenze della contaminazione. Non solo si spreca tempo ed energia, ma i risultati della ricerca non possono essere riprodotti e l'impatto è molto grave. Per questo motivo, istituzioni autorevoli come NIH e ATCC hanno ripetutamente invitato i ricercatori a identificare le cellule. Nell'aprile 2015, Nature ha annunciato che tutte le sue riviste avrebbero richiesto agli autori di identificare le linee cellulari utilizzate nei loro articoli. In seguito, a giugno, è stato riferito che uno scienziato ha ritirato l'articolo di Nature a causa di problemi con le linee cellulari. Nell'ottobre 2017, un articolo pubblicato sulla rivista PLoS ONE ha affermato che c'è stata una contaminazione incrociata delle linee cellulari HeLa utilizzate in più di 30.000 articoli, rendendo i risultati della ricerca non validi[1]. Un altro studio del 2019 ha dimostrato che almeno il 24% delle linee cellulari umane era contaminato da HeLa[2].

Limitazione 3: Applicazione delle cellule

Molte cellule non riescono a proliferare in vitro e ogni esperimento richiede l'isolamento di cellule primarie da tessuti freschi. Ad esempio, neuroni, cellule muscolari scheletriche, cardiomiociti, periciti ed epatociti terminalmente differenziati, ecc.

Inoltre, lo stato delle cellule primarie è il più vicino all'ambiente fisiologico del corpo e può mantenere alcune caratteristiche biologiche del tessuto. Pertanto, è la scelta migliore per valutare l'efficacia e la virulenza dei farmaci e, allo stesso tempo, la probabilità di contaminazione incrociata è notevolmente ridotta. Inoltre, per gli studi legati all'oncologia e all'immunologia, se sono coinvolti modelli animali viventi, è necessario isolare le cellule primarie. Tuttavia, la difficoltà di coltivare le cellule primarie è molto più elevata di quella delle linee cellulari ordinarie. Nel frattempo, l'isolamento e la preparazione di cellule primarie sono sempre stati un problema urgente da risolvere. Con la premessa di garantire la riproducibilità, come preparare in modo efficiente una sospensione monocellulare ad alta attività?

Il dissociatore di sospensione monocellulare RWD risolve facilmente questo problema. La provetta per il trattamento dei tessuti, il kit di digestione enzimatica e i programmi di ottimizzazione integrati consentono di preparare sospensioni monocellulari e omogeneizzati di tessuto ad alta attività.

Lo strumento può completare rapidamente la preparazione di sospensioni monocellulari ad alta attività e buona uniformità, aumentando la ripetibilità degli esperimenti. Dispone di quattro canali indipendenti e la camicia di riscaldamento può migliorare l'efficienza del trattamento dei tessuti. È ampiamente utilizzato in immunologia, oncologia, neurobiologia e altri campi di ricerca.

Dopo aver ottenuto la sospensione cellulare singola, le cellule devono essere contate e analizzate per verificarne la vitalità e collocate in un sistema di coltura o in un sistema tampone corrispondente. Il contacellule automatico C100 di RWD è in grado di contare accuratamente le cellule primarie. Grazie ai canali di fluorescenza multipli, è in grado di analizzare rapidamente e quantitativamente le cellule in sospensione e di visualizzare simultaneamente immagini in campo chiaro e in fluorescenza, mostrando chiaramente i risultati del conteggio e la morfologia cellulare. È molto adatto per l'immunologia, lo sviluppo di vaccini, la terapia cellulare, la ricerca sui tumori, le cellule staminali, la ricerca metabolica e altri campi.

La coltura cellulare è l'ultima fase del processo di separazione delle cellule primarie. L'incubatore RWD CO2 può controllare con precisione la temperatura e la concentrazione di anidride carbonica e mantenere un ambiente ad alta umidità. Il filtro HEPA ad alta efficienza può rimuovere efficacemente l'inquinamento particellare nell'aria e la sterilizzazione a calore secco a 140°C può realizzare la sterilizzazione e la manutenzione regolare dell'incubatore, fornendo un ambiente di coltura stabile e pulito per i campioni di cellule primarie.

referenze

1. Serge P. J. M. Horbach, Willem Halffman. I fantasmi di HeLa: come l'errata identificazione delle linee cellulari contamina la letteratura scientifica. PLoS ONE， Pubblicato：12 ottobre 2017， doi：10.1371/journal.pone.0186281

2. Lin J, Chen L, Jiang W, Zhang H, Shi Y, Cai W. Rilevazione rapida della contaminazione di basso livello delle cellule HeLa in coltura cellulare mediante PCR nested. J Cell Mol Med.2019;23(1):227-236. doi:10.1111/jcmm.13923