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Come preparare rapidamente campioni di sospensione di cellule nervose di ratto o topo di alta qualità?
I neuroni (chiamati anche neuroni o cellule nervose) sono le unità fondamentali del cervello e del sistema nervoso, l'isolamento e la coltura del nervo in vitro si è dimostrato un approccio molto potente nell'affrontare il processo neurobiologico nel
Le colture di neuroni primari sono potenti sistemi modello utilizzati per studiare la morfologia e la differenziazione dei neuroni, la funzione sinaptica e il rilascio di neurotrasmettitori, la neurotossicità durante lo sviluppo preclinico di farmaci e la modellazione della malattia. Poiché i neuroni non si dividono e non proliferano nuovamente dopo la separazione, stabilire un metodo facile, riproducibile ed economico per isolare e coltivare le cellule nervose primarie farebbe avanzare notevolmente la ricerca neuroscientifica.
Tuttavia, i neuroni primari sono altamente sensibili alle condizioni di isolamento e alla loro coltura o ambiente di crescita. Poiché i metodi differiscono da laboratorio a laboratorio, le rese cellulari, la vitalità e i tassi di maturazione sono molto variabili e rendono difficile confrontare i risultati e ripetere gli esperimenti tra i laboratori.
Quindi, come preparare rapidamente campioni di sospensione di cellule nervose di ratto/topo di alta qualità?
Rispetto ai topi neonati, la dissociazione del cervello di ratto adulto è più complessa e richiede una combinazione di idrolisi meccanica ed enzimatica per degradare la matrice extracellulare. Tipicamente, la rimozione della mielina richiede un periodo di incubazione prolungato con enzimi di digestione, grave disintegrazione meccanica e/o fasi aggiuntive per la purificazione della mielina, che compromettono del tutto il recupero e la vitalità delle sospensioni cellulari primarie.
In questo protocollo, descriviamo un metodo per isolare le cellule neurali del topo utilizzando una delicata formulazione dell'enzima di digestione dei tessuti. Gli strumenti sperimentali dettagliati, i materiali e la procedura sperimentale sono elencati come segue.
Strumenti e materiali sperimentali
RWD DSC-400 dissociatore a sospensione a cella singola;
RWD HJ-400 Giacca riscaldante;
RWD DHABE-5003 Kit per la digestione enzimatica del cervello adulto ad alta attività (topo e ratto);
RWD SCT-100 Tubo per l'elaborazione dei tessuti;
Filtro a celle da 70μm;
RWD Strumento chirurgico per animali;
Forniture per colture cellulari; Pipetta.
procedura sperimentale
Secondo le istruzioni, mescolare l'enzima MIX e attivarlo con bagnomaria a 37℃.
I tessuti cerebrali di ratti adulti (P>7) sono stati sezionati e temporaneamente conservati in piastre di Petri contenenti HBSS (Ca2+ e Mg2+). I vasi sanguigni dei tessuti cerebrali sono stati delicatamente rimossi il più possibile con una pinzetta
Mettere il tessuto cerebrale e l'enzima MIX nel tubo di elaborazione dei tessuti e tagliare l'intero cervello in 4 pezzi con le forbici.
Capovolgere il tubo di trattamento dei tessuti al dissociatore di sospensione a cellula singola, installare la camicia di riscaldamento ed eseguire il programma M_ABrain_Heater_2.
I campioni di sospensione cellulare sono stati filtrati con un filtro cellulare e centrifugati per 10 minuti a 300 × g a temperatura ambiente.
6. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 15 ml, aggiungere il reagente di deframmentazione, mescolare bene, stendere lo strato superiore con PBS pre-raffreddato e far girare a 3000×g per 10 minuti a 4°C con velocità 5 e decremento 3. Il mantenere lo strato inferiore di pellet cellulari, lavare e raccogliere.
7. Operazione rosso crepa (opzionale).
8. Conta cellulare e citometria a flusso
Le cellule del tessuto cerebrale del topo adulto elaborate dall'apparato dissociatore della sospensione a cellula singola RWD possono raggiungere il 90% di vitalità cellulare, che è la percentuale ideale per l'esperimento a valle. RWD DHABE-5003 Il kit di enzimazione delicata del tessuto cerebrale adulto del topo può essere utilizzato per il dissociatore di sospensione a cellula singola dell'intero tessuto cerebrale di ratto o topo adulto (P>7). Può anche supportare l'isolamento di tutte le cellule neurali e non neurali nel cervello.
