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Maggiori informazioni sulla fotometria in fibra: principio di funzionamento e processo
Questo articolo contiene più di 3.000 parole per spiegare il principio di funzionamento e i vantaggi e mostra i passaggi per impostare l'esperimento pertinente.
A. Principio di funzionamento della fotometria della fibra.
B. Vantaggi della fotometria in fibra.
C. Come utilizzare la tecnologia di fotometria in fibra?
D. Configurazione del sistema di fotometria in fibra e registrazione di un buon segnale.
F. Analisi dei dati di fotometria in fibra.
A. Fotometria della fibra Principio di funzionamento
Il cervello umano ha circa 90 miliardi di neuroni, che sono interconnessi da sinapsi per formare una complessa rete neurale, e quindi producono varie funzioni complesse. Il cervello può sintetizzare e rilasciare centinaia di neurotrasmettitori e i segnali nervosi vengono trasmessi tra i neuroni attraverso i neurotrasmettitori rilasciati dalle sinapsi. Quando l'eccitazione nervosa viene trasmessa all'estremità della sinapsi, stimolerà il canale del calcio sulla sinapsi ad aprirsi e promuovere l'afflusso di ioni calcio e la concentrazione di ioni calcio intracellulari aumenterà istantaneamente, guidando le vescicole sinaptiche a rilasciare neurotrasmettitori nello spazio sinaptico e che si legherà ai recettori sulla membrana postsinaptica e trasmetterà i segnali del neurotrasmettitore al neurone successivo, trasmettendo così l'informazione passo dopo passo
Prendendo come esempio il rilevamento del segnale di fluorescenza del calcio, il principio tecnico del sistema di fotometria in fibra consiste nell'utilizzare uno speciale indicatore fluorescente o una sonda di fluorescenza con l'aiuto della stretta corrispondenza tra il cambiamento della concentrazione di calcio e l'attività neuronale. La concentrazione di calcio nel neurone viene espressa attraverso l'intensità della fluorescenza e catturata dal sistema di fotometria delle fibre, in modo da raggiungere lo scopo di rilevare l'attività neuronale.
Nel sistema nervoso, la concentrazione di calcio intracellulare dei neuroni a riposo è 50-100 nM, ma quando i neuroni sono eccitati, la concentrazione di calcio intracellulare può aumentare di 10-100 volte, quindi possiamo etichettare gli ioni calcio iniettando indicatori di codifica del gene del calcio ( Indicatore di calcio, come GCaMPs, RCaMPs, ecc.). Quando l'attività neurale è potenziata, il canale del calcio si apre, una grande quantità di calcio affluisce e si lega con CaM, determinando l'interazione tra i domini M13 e CaM, portando a cpEGFP strutturale riarrangiamento, migliorando così il segnale di fluorescenza verde. （Figura 1） Pertanto, possiamo caratterizzare l'attività dei neuroni rilevando i cambiamenti dei segnali del calcio, quindi studiare la correlazione tra attività neuronale e comportamento animale ed esplorare il meccanismo di regolazione alla base del comportamento complesso .
Il principio della fotometria in fibra per il rilevamento dei segnali dei neurotrasmettitori è lo stesso di cui sopra. È stata sviluppata una nuova serie di sonde fluorescenti geneticamente codificabili, denominate GRAB (GPCR activation-based). Incorporando una proteina fluorescente (cpEGFP) sensibile ai cambiamenti strutturali nel recettore del neurotrasmettitore, il gruppo di ricerca è stato in grado di convertire il segnale chimico del neurotrasmettitore in un segnale fluorescente e, in combinazione con le tecniche di imaging esistenti, di monitorare i cambiamenti dinamici della concentrazione del neurotrasmettitore in tempo reale
B. Vantaggi della fotometria in fibra
Lo studio del sistema nervoso degli animali svegli e che si muovono liberamente è una questione cruciale nella ricerca neuroscientifica contemporanea. Rilevando i segnali di calcio associati all'attività neuronale, siamo in grado di comprendere meglio i circuiti neurali complessi. Negli ultimi anni, gli sviluppi tecnologici, tra cui la microscopia a due fotoni, la microscopia a fotone singolo e la fotometria in fibra, ci hanno permesso di eseguire il rilevamento in tempo reale dei cambiamenti nei segnali del calcio negli animali. L'applicazione di queste tecniche richiede proteine fluorescenti ingegnerizzate.
In passato, la maggior parte dell'imaging del calcio in vivo veniva eseguita al microscopio a due fotoni. La microscopia a due fotoni è una tecnica di imaging a fluorescenza in cui due fasci di luce laser coerente vengono focalizzati attraverso l'oculare di un microscopio in un punto definito da una funzione di diffusione del punto, simile alla microscopia confocale che eccita selettivamente molecole simili a fluorescenti. Nella microscopia a due fotoni, la lunghezza d'onda della luce di eccitazione è vicina a 700-1000 nm, vicino allo spettro infrarosso. Questo è il primo vantaggio dell'imaging a due fotoni in vivo: lunghezze d'onda più lunghe della luce si disperdono meno nel tessuto e penetrano a profondità maggiori. La seconda è la buona risoluzione che permette la visualizzazione non solo dei singoli neuroni ma anche dell'attività del calcio alle estremità degli assoni delle strutture subcellulari.
Le tecniche di scansione laser nella microscopia a due fotoni vengono utilizzate anche per rilevare la dinamica rapida del calcio nei neuroni durante l'imaging in vivo, ma la potenza di eccitazione per distinguere il segnale dal rumore di solito deve essere sufficientemente alta da causare un certo grado di sbiancamento e i timeout del fotosbiancamento possono influire negativamente sulla qualità dell'immagine.
