Come ottenere sezioni di paraffina di alta qualità?

Questo testo vi fornirà i metodi dettagliati per tagliare sezioni qualificate in paraffina.

Il sezionamento in paraffina è il metodo più utilizzato per la preparazione delle sezioni istologiche. Tuttavia, ci sono alcune domande che spesso incontriamo durante il taglio del tessuto incluso in paraffina: perché il blocco di cera non può essere tagliato senza problemi? Perché durante il taglio è facile che si verifichino rotture e arrotolamenti delle sezioni? Perché le sezioni non possono essere appiattite durante la stesura? Questo testo vi fornirà i metodi dettagliati per tagliare sezioni qualificate in paraffina.

Fissazione corretta

Dopo la separazione dei tessuti, è necessario fissarli entro 1 ora.

Il liquido di fissaggio deve essere da 4 a 10 volte il volume del tessuto e avere una concentrazione accurata. Un liquido eccessivamente sottile e ricco compromette la forma del tessuto e l'effetto di fissazione. In caso di deterioramento del liquido stazionario, come ad esempio la precipitazione bianca del liquido di formaldeide, è necessario procedere all'immediata sostituzione.

La temperatura di fissazione deve essere di 35-37°C a temperatura ambiente o in un processore per tessuti completamente chiuso. Una temperatura troppo elevata accelera l'autolisi del tessuto e l'eccessiva contrazione, distruggendo l'antigene e il DNA delle cellule.

Il tempo di fissazione non deve superare le 40 ore e deve essere regolato in base alla temperatura ambiente e ai campioni.

Disidratazione appropriata

La chiave della disidratazione è far sì che il tempo di disidratazione dell'alcol a bassa concentrazione corrisponda al tempo di disidratazione dell'alcol ad alta concentrazione. L'alcol a bassa concentrazione può ridurre la contrazione dei tessuti e facilitarne il taglio. L'alcol ad alta concentrazione può disidratare ulteriormente i tessuti.

In genere, il tempo di disidratazione dei campioni (35°C) è di 1,5 ore per l'alcol al 75%, 2 ore per l'alcol all'85%, da 1,5 a 2 ore per l'alcol al 95% (due volte) e da 1,5 a 2 ore per l'alcol puro (due volte). Il tempo di disidratazione dei campioni piccoli è poco diverso da quello dei campioni grandi. Normalmente, non è necessario separarli (spesso i piccoli campioni sono fragili a causa della confezione di carta spessa o si attaccano l'uno all'altro, il che porta a una disidratazione incompleta dei tessuti). Se i tempi sono urgenti, è possibile abbreviare il tempo di disidratazione. La durata della disidratazione è strettamente correlata alla temperatura ambiente, allo spessore e al tipo di tessuto, al grado di fissazione del tessuto, ecc.)

L'accuratezza della disidratazione è direttamente associata alla trasparenza del tessuto. Se la temperatura è troppo alta (oltre i 50°C) o se si utilizza l'acetone durante la disidratazione, è facile che si verifichi un'eccessiva contrazione dei tessuti e che questi risultino induriti e fragili. Le ragioni della fragilità dei tessuti causata dalla disidratazione sono tre:

Falsa fragilità: a causa di una disidratazione insufficiente, la paraffina non riesce a penetrare nei tessuti quando questi vengono immersi nella cera. Se i tessuti vengono "cotti" ad alta temperatura, diventano duri e fragili. Le sezioni presenteranno parti polverose o filamentose. I tessuti duri, come il leiomioma uterino, presenteranno anche dei bordi e, nel peggiore dei casi, l'intera sezione collasserà verso l'esterno. I tessuti con una disidratazione gravemente insufficiente diventano morbidi e presentano persino acqua.

Punti operativi del sezionamento con paraffina

Prima del sezionamento, stringere l'asta di bloccaggio o la vite sul microtomo, altrimenti si può verificare il salto di sezione e uno spessore non uniforme delle sezioni.

Raschiare la paraffina residua intorno alla scatola di inclusione, altrimenti il bloccaggio del campione potrebbe allentarsi e compromettere la qualità della sezione.

Rifilare correttamente il blocco ed eseguire prima una rifilatura grossolana. Lo spessore è di circa 15-30 micron; i tessuti più duri o più piccoli dovrebbero essere più sottili. Dopo la rifilatura grossolana fino a quando tutti i tessuti sono esposti, si può procedere alla rifilatura fine.

Si seleziona la modalità di congelamento dei blocchi di paraffina e la scatola del ghiaccio è superiore al tavolo di congelamento. Utilizzare un contenitore di ghiaccio per bagnare i blocchi di paraffina aggiungendo acqua. Ha i vantaggi della velocità di congelamento, delle dimensioni ridotte, del basso costo di utilizzo e dell'assenza di alimentazione esterna.

Durante il sezionamento della paraffina, tenere delicatamente il volantino con una forza uniforme e delicata; l'agitazione non deve essere né troppo rapida né troppo lenta. Se la velocità è troppo alta, lo spessore della sezione non è uniforme e la sezione ha difficoltà a espandersi. Se la velocità è troppo bassa, la sezione si ispessisce. Le sezioni devono essere complete, sottili e uniformi.

Dopo il sezionamento con paraffina, mettere la sezione prima in acqua fredda e poi spostarla in acqua calda, in modo che la sezione sia più sottile, con meno rughe e bolle. La temperatura dell'acqua della fetta da spalmare deve essere compresa tra 42-55°C, in relazione al punto di fusione della paraffina da incorporare. Se la temperatura dell'acqua è troppo alta, i tessuti e le cellule si disperdono. Se la temperatura dell'acqua è troppo bassa, le rughe delle sezioni non possono essere appiattite.