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Come gestire la microiniezione di Caenorhabditis Elegans? Non perdetevi i dettagli passo dopo passo!

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La microiniezione di C Elegans è la tecnica principale del paradigma di ricerca di C Elegans. Scoprite i dettagli passo-passo della procedura sperimentale!

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Background della microiniezione di C Elegans

Il Caenorhabditis elegans (c elegans) è un importante organismo modello utilizzato per lo studio della genetica animale, dell'ontogenesi e dell'etologia. Può aiutarci a studiare il meccanismo d'azione dal livello molecolare e cellulare al livello biologico del sistema, in relazione al corrispondente ciclo vitale. La tecnologia della microiniezione prevede un tubo di vetro capillare con una punta di millimetri di diametro per l'iniezione di acidi nucleici nella gonade del verme, che vengono successivamente assorbiti dalle cellule uovo e generati sotto forma di matrici extracromosomiche. La microiniezione in C elegans è la tecnica principale del paradigma di ricerca in C elegans. È ampiamente utilizzata per studiare l'espressione genica, la funzione genica e le interazioni genetiche all'interno del corpo di C elegans.

Protocollo di microiniezione in C elegans

Fase 1: preparazione delle piastre di agar

Lasciare cadere 50ul di soluzione di agarosio caldo al 2% su un vetrino coprioggetto di 24 × 60 mm e sovrapporre delicatamente un altro coprioggetto (attenzione alle bolle d'aria). Dopo che l'agarosio appiattito si è solidificato (~5 min), è possibile rimuovere il vetrino coprioggetto sopra di esso facendolo scorrere delicatamente. Lasciare asciugare la piastra di agar per una notte a temperatura ambiente o cuocerla a 80℃ per 1 ora. Impilare le piastre per un uso successivo

Fase 2: preparazione degli aghi

L'ago è la chiave del successo della microiniezione di C elegans. L'estrattore di micropipette RWD aiuta a generare 2 aghi con prestazioni stabili e costanti. Si raccomanda di utilizzare il tubo di vetro capillare RWD per l'estrazione delle pipette, in modo da riempire rapidamente la punta degli aghi con la soluzione madre. In questo modo, le bolle d'aria possono essere scaricate. In generale, i diametri dei puntali sono inferiori a 1μm e la lunghezza del cono è di circa 5~7 mm.

Fase 3: preparazione del DNA e riempimento della pipetta ad ago

In base ai requisiti sperimentali, scegliere le sostanze per la soluzione madre. Ad esempio, DNA, RNA, proteine e altre sostanze. La purezza della soluzione madre è uno dei fattori importanti che influenzano l'efficienza dell'iniezione. Utilizzare un contagocce chimico piccolo e sottile per introdurre la soluzione madre nella pipetta attraverso la punta degli aghi. Dopo alcuni minuti, osservare la punta per vedere se ci sono bolle d'aria

Fase 4: rottura

Posizionare il coprioggetto sulla piastra di agar riempita con la soluzione madre. Muovere il micromanipolatore RWD per rompere l'ago contro il bordo del vetrino. Quando la punta si rompe, il vacuolo fuoriesce. Questo metodo consente una facile penetrazione dell'ago nel verme

Fase 5: montaggio dei vermi

I giovani vermi gravidi sono comunemente selezionati per la microiniezione, in quanto le loro gonadi sono completamente sviluppate in questa fase in cui i vermi sono facilmente soggetti alla trasfezione del DNA, con conseguente generazione di prole transgenica. Usare un plettro per posizionare il verme sulla piastra di agar. Regolare la posizione in modo che la gonade sia esposta all'esterno. Aggiungere alcune gocce di olio di alocarbonio per coprire completamente il verme.

Fase 6: microiniezione

Posizionare la piastra di agar sul palcoscenico meccanico. Individuare il verme al microscopio e mettere a fuoco la gonade regolando la lente del condensatore. Utilizzare il micromanipolatore RWD per inserire l'ago nella gonade. Accendere la pompa di microiniezione RWD Nanoliter per iniziare l'iniezione

Fase 7: Recupero dei vermi

Aggiungere alcune gocce di soluzione tampone al verme iniettato sotto lo stereomicroscopio. Dopo 2-5 minuti, il verme tornerà attivo. Dovrebbe iniziare a nuotare e a muovere la testa da un lato all'altro. A questo punto, è possibile trasferirlo di nuovo nelle piastre di coltura cellulare per la coltivazione regolare a 20℃.

Precauzioni[2]

Piastre di agar: Se il verme muore rapidamente sulla piastra di agar, ciò indica che la piastra è troppo secca. In questo caso, è possibile sostituirla con un'altra piastra con uno strato di agar più sottile, poiché l'agarosio serve principalmente ad assorbire l'acqua dal verme; se il verme non riesce ad aderire saldamente alla piastra, è un'indicazione che la piastra è troppo bagnata o troppo sottile. In questo caso, si consiglia di metterla in forno per un certo periodo di tempo o di far aderire il verme sulla piastra prima di aggiungere l'olio alocarbonico

Sostanze da iniettare: Mantenere la soluzione di DNA ben miscelata e centrifugata prima dell'iniezione per evitare che la punta dell'ago si intasi. La concentrazione di DNA deve essere mantenuta al di sotto di 200 mg/l, poiché una soluzione di DNA altamente concentrata produce tossine e porta a una sovraespressione genica

Orientamento dell'iniezione: L'ago e la gonade devono essere posizionati ad angolo retto. Si raccomanda di posizionare l'ago orizzontalmente o con un angolo di 15° rispetto alla testa o alla coda.

Campione utilizzato nell'esperimento: Assicurarsi che i vermi iniettati siano ben nutriti e sani.

Alto tasso di morte dei vermi iniettati: Per il recupero dei vermi, se il tempo impiegato è troppo lungo o troppo breve, potrebbe essere dovuto all'ago troppo grande o alla contaminazione del DNA iniettato. Per risolvere questo problema, il rimedio potrebbe essere un ago più sottile. Inoltre, provare a iniettare solo una gonade alla volta. Se la procedura di microiniezione è stata eseguita correttamente ma non si formano vermi transgenici, le possibili cause possono essere la letalità indotta dalla trasformazione genetica o l'inquinamento degli acidi nucleici iniettati che richiede una nuova purificazione

Riferimenti:

[1] Matthias Rieckher e Nektarios Tavernarakis. Generazione di animali transgenici di Caenorhabditis elegans mediante microiniezione di DNA [J].Bio Protocol, 2017, 7(19): e2565.

[2] Krishna S. Ghanta et al., Microinjection for precision genome editing in Caenorhabditis elegans[J].Star Protocols, 2021, 2(3): 100748.