Manuale o automatizzato, quale scegliere per il conteggio delle cellule?

conteggio delle cellule manuale e automatizzato

La coltura cellulare è un passaggio fondamentale nella ricerca sulla biologia cellulare. Per garantire una crescita cellulare sana e facilitare gli esperimenti a valle, i ricercatori devono determinare la curva di crescita cellulare e comprendere il loro stato di crescita durante la coltura cellulare, quindi la concentrazione cellulare, la vitalità e la concentrazione devono essere misurate prima degli esperimenti a valle. In genere, i metodi di conteggio delle cellule includono il conteggio manuale e il conteggio automatico.

Questo articolo introduce i vantaggi e gli svantaggi del conteggio manuale delle celle e del conteggio automatico delle celle, insieme a un'introduzione dettagliata di questi due metodi.

Vantaggi e svantaggi della cella manuale e automatizzata

Conteggio

Metodo

Conteggio cellulare manuale

Tempo di conteggio: 5 minuti/campione

Precisione conteggio singolo: bassa

Analisi dei campioni a grappolo: calcolo approssimativo

Rischio biologico: sì

Calcolo secondario: sì

Area del campo visivo: 1 mmq

Gestione dei dati: manuale

Costo dei materiali di consumo: Basso

Costo del lavoro: alto

Contatore automatico di cellule

Tempo di conteggio: 9 sec/campione

Precisione di conteggio singolo: alta

Analisi dei campioni a grappolo: separazione accurata

Rischio biologico: No

Calcolo secondario: no

Area del campo visivo: 3,5 mmq

Gestione dei dati: automatizzata

Costo dei materiali di consumo: leggermente superiore

Costo del lavoro: Basso

Conteggio delle cellule mannuale

La conta cellulare annua, sviluppata dall'anatomista e istologo francese Louis-Charles Malassez nel XVIII secolo, è stata a lungo considerata il gold standard per la misurazione della concentrazione cellulare.

Procedura per il conteggio manuale delle cellule mediante emocitometro

1 Raccogliere e colorare le cellule

Raccogliere la sospensione cellulare e macchiare con coloranti tripan blu o AO/PI.

2 Pulire l'emocitometro

Pulire l'emocitometro, quindi asciugarlo all'aria o utilizzare un essiccatore. E puoi anche scegliere solventi organici come etanolo al 95%, etanolo assoluto o acetone per disidratarlo. Assicurati di non strofinare l'emocitometro con qualcosa di duro.

3 Posizionare il coprioggetto, quindi caricare il campione

Posizionare il coprioggetto appropriato sopra l'emocitometro per formare una camera di conteggio. Pipettare una goccia della sospensione cellulare sul bordo del coprioggetto e consentire alla sospensione cellulare di fluire nella camera delicatamente e in modo uniforme, evitando bolle.

4 Osservazione e posizionamento del microscopio

Trova un campo visivo adatto al microscopio e osserva il campione di cellule. Regola la messa a fuoco per ottenere una visione chiara e trova il quadrato di destinazione. Quando si utilizza il colorante AO/PI, utilizzare un microscopio a fluorescenza per l'osservazione.

5 Conteggio manuale al microscopio

Guarda il campione al microscopio e conta manualmente il numero di cellule. Questo conteggio viene ripetuto tre volte, tenendo conto di celle di dimensioni diverse, e viene preso il valore medio.

6 Calcolare la concentrazione

Calcolare la concentrazione di cellule nel campione utilizzando la formula di conversione e i dati registrati. Se si utilizza la colorazione tripan blu, separare le cellule vive dalle cellule totali.

7 Pulire l'emocitometro

Pulire l'emocitometro come descritto sopra e conservarlo per un uso futuro.

Scenario dell'applicazione per il conteggio manuale delle cellule

Conteggio delle celle a basso rendimento

Appunti

● La pulizia casuale dell'emocitometro può causare rischi biologici.

● A causa del materiale dell'emocitometro, i graffi sulla superficie possono compromettere seriamente i risultati sperimentali.

● Le impurità lasciate possono causare una distribuzione irregolare delle cellule.

● I residui di detergenti possono compromettere la vitalità cellulare.

● Poche celle raggruppate devono essere contate come una cella, mentre i campioni con più cluster devono essere risospesi e misurati.

● Il principio di conteggio per le celle premute sulle linee della griglia deve essere determinato in anticipo.

Conteggio automatico delle cellule

Sebbene la scheda per il conteggio delle cellule del sangue sia considerata il gold standard per il conteggio delle cellule, ci sono problemi intrinseci con il suo design e il suo utilizzo. I contatori automatici di cellule sono stati sviluppati per superare questi problemi.

Esistono tre tipi comuni di contatori di cellule automatizzati: contatori di cellule automatizzati basati sulla visione, contatori di cellule di tipo Coulter e citometri a flusso.

Di questi, il contatore di cellule automatizzato basato sulla visione produce risultati simili al conteggio manuale, che ora è il gold standard, grazie alla sua elevata velocità di conteggio e principi simili. Il contatore automatico può rilevare cellule e particelle e quindi applicare algoritmi per misurare la concentrazione cellulare, le dimensioni e altri parametri. Ciò consente la determinazione della concentrazione e del numero di seeding cellulare, nonché della vitalità cellulare e della proliferazione.

Procedura per il conteggio automatico delle cellule

(1) Cellule di raccolta e colorazione.

(2) Caricare il campione su un vetrino di conteggio usa e getta.

(3) Inserire il vetrino nello strumento.

(4) Lo strumento visualizza immediatamente i risultati del conteggio.

Applicazioni automatiche per il conteggio delle cellule

Conteggio delle celle ad alto rendimento.

I contatori di cellule automatizzati possono essere utilizzati con vari tipi di apparecchiature ottiche e possono quindi essere aggiornati a contatori di cellule automatizzati a fluorescenza per la doppia fluorescenza diretta AO/PI.

Appunti

(1) I parametri di conteggio devono essere impostati in base al campione.

(2) Il moltiplicatore di prediluizione deve essere inserito in anticipo.

(3) La precisione dell'autofocus dovrebbe essere controllata e qualsiasi deviazione dovrebbe essere corretta immediatamente.

Riepilogo

Il conteggio manuale delle cellule con un emocitometro è spesso soggetto a errori. Inoltre, una pulizia impropria dell'emocitometro può rappresentare un rischio biologico. In confronto, il conteggio automatico delle celle è superiore al conteggio manuale delle celle in termini di accuratezza dei dati ed efficienza della velocità. Inoltre, lo United States Pharmacopeia-National Formulary (USP-NF) raccomanda l'uso di almeno due o più metodi per determinare la vitalità cellulare dopo il recupero. Oltre alla colorazione blu trypan in campo chiaro, il metodo di colorazione AO/PI è comunemente utilizzato per il conteggio delle cellule vive basato sulla fluorescenza. Pertanto, un contatore di cellule automatizzato con funzionalità di fluorescenza è più conveniente per il conteggio delle cellule basato sia sul campo chiaro che sulla fluorescenza, rendendolo più adatto agli attuali scenari di ricerca sulla biologia cellulare.