Il trattamento con elettroagopuntura allevia con successo i sintomi della BPCO in modelli sperimentali di ratto

mostrando un potenziale come terapia aggiuntiva per la BPCO in futuro

La broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO) è la terza causa di morte nel mondo e gli attuali trattamenti farmacologici sono associati a effetti collaterali. Recentemente, i ricercatori Lu Liu, Zili Tang e colleghi hanno pubblicato sul Journal of Inflammation Research uno studio intitolato "Transcriptomic Insights into Different Stimulation Intensity of Electroacupuncture in Treating COPD in Rat Models".

Questo studio mirava a indagare gli effetti terapeutici e i meccanismi molecolari dell'elettroagopuntura a intensità di 1mA e 3mA sulla BPCO in modelli di ratto. Attraverso la creazione del modello, il raggruppamento del trattamento, il rilevamento multiparametrico e l'analisi omica, i ricercatori hanno scoperto che entrambe le intensità miglioravano la funzione polmonare, ma i modelli di espressione genica variavano. Hanno identificato otto geni candidati e le relative vie di espressione, fornendo nuovi obiettivi e spunti per il trattamento della BPCO con l'elettroagopuntura.

1. Background della ricerca

La broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO) è caratterizzata da infiammazione cronica, distruzione alveolare e ostruzione delle piccole vie aeree ed è la terza causa di morte a livello globale. Gli attuali trattamenti farmacologici sono associati a effetti collaterali, mentre l'elettroagopuntura (EA) ha dimostrato una certa efficacia nel trattamento clinico. Tuttavia, l'intensità della stimolazione non è ancora standardizzata. Questo studio si propone di confrontare gli effetti e i meccanismi terapeutici dell'elettroagopuntura da 1mA e 3mA sulla BPCO in modelli di ratto e di rivelare i meccanismi di regolazione molecolare attraverso l'analisi trascrittomica.

2. Metodi sperimentali

2.1 Animali sperimentali e raggruppamento

Selezione degli animali: Ratti maschi Sprague-Dawley di 12-14 settimane di età.

Raggruppamento degli animali: I ratti sono stati suddivisi in modo casuale in quattro gruppi, ciascuno composto da sei animali: gruppo di controllo normale (NC), gruppo BPCO, gruppo BPCO+1mA-EA (EA-1mA) e gruppo BPCO+3mA-EA (EA-3mA).

2.2 Costituzione del modello di BPCO e trattamento con elettroagopuntura

Creazione del modello: Il modello di BPCO è stato indotto utilizzando una combinazione di fumo passivo (CS) e iniezione intratracheale di lipopolisaccaridi (LPS). I ratti sono stati esposti al fumo di sigaretta in un sistema di esposizione su tutto il corpo per 2 ore al giorno per 12 settimane, con iniezioni di LPS somministrate nei giorni 1, 31 e 61.

Trattamento con elettroagopuntura: A partire dal giorno 77, l'elettroagopuntura è stata praticata sui ratti dei gruppi EA-1mA e EA-3mA per 20 minuti al giorno per due settimane. Sono stati selezionati gli agopunti BL13 (Feishu) e ST36 (Zusanli), con profondità di inserimento dell'ago rispettivamente di 6 mm e 7 mm. Sono state applicate onde sparse-dense con una frequenza di 4/20Hz e intensità di 1mA e 3mA. I ratti dei gruppi NC e COPD sono stati sottoposti ad anestesia senza EA.

2.3 Indicatori di valutazione

Valutazione della funzione polmonare: I parametri di funzionalità polmonare, tra cui il volume espiratorio forzato (FEV), la capacità vitale forzata (FVC) e il rapporto FEV/FVC, sono stati misurati utilizzando un sistema di test di funzionalità polmonare per animali da esperimento.

Esame istopatologico: La morfologia del tessuto polmonare è stata valutata mediante colorazione con ematossilina ed eosina (HE) e l'infiltrazione infiammatoria è stata rilevata mediante colorazione immunoistochimica (IHC). Sono stati calcolati il rapporto superficie alveolare/area interstiziale (A/S) e la densità ottica media (IOD/area) di macrofagi e linfociti T.

Indicatori di stress infiammatorio e ossidativo: I livelli sierici di interleuchina-6 (IL-6), interleuchina-1β (IL-1β), interleuchina-10 (IL-10) e fattore di necrosi tumorale-α (TNF-α) sono stati misurati mediante saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA). Sono stati utilizzati kit biochimici per misurare i livelli di superossido dismutasi (SOD), malondialdeide (MDA) e glutatione perossidasi (GSH-Px) nel siero e nel tessuto polmonare.

Sequenziamento trascrittomico (RNA-Seq) e analisi: L'RNA totale è stato estratto dal tessuto polmonare per l'analisi RNA-Seq per identificare i geni differenzialmente espressi (DEG). Sono state eseguite analisi di arricchimento dei percorsi della Gene Ontology (GO) e della Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). L'analisi della rete di co-espressione genica ponderata (WGCNA) è stata utilizzata per costruire reti di co-espressione genica e determinare la relazione tra moduli e tratti.

Convalida mediante RT-qPCR e Western Blot (WB): I DEG selezionati sono stati convalidati a livello di mRNA e proteine utilizzando rispettivamente RT-qPCR e WB.

2.4 Analisi statistica

I dati sono stati espressi come media ± deviazione standard (SD) e sono stati analizzati con il software Prism 9.0. Per i dati con distribuzione normale e omogeneità della varianza, è stata utilizzata l'analisi della varianza (ANOVA) a una via, seguita da test di differenza minima significativa (LSD) per i confronti a coppie. Per i dati non distribuiti in modo normale, è stato applicato il test di Kruskal-Wallis. La significatività statistica è stata fissata a p < 0,05.

3. Risultati sperimentali

3.1 Effetti dell'elettroagopuntura sulla funzione polmonare, l'infiammazione e lo stress ossidativo nei ratti con BPCO

Miglioramento della funzione polmonare: Rispetto al gruppo NC, il rapporto FEV/FVC nel gruppo BPCO era significativamente ridotto, indicando una grave limitazione del flusso aereo. Entrambi i trattamenti con EA-1mA e EA-3mA hanno migliorato significativamente il rapporto, anche se non è stata osservata alcuna differenza significativa tra i due gruppi EA.

Cambiamenti istopatologici:

La colorazione HE ha mostrato un ispessimento dei setti alveolari, la formazione di enfisema e l'infiltrazione di cellule infiammatorie nel gruppo BPCO. Il rapporto A/S era ridotto e il numero di cellule infiammatorie era aumentato. Il trattamento con EA-3mA ha aumentato significativamente il rapporto A/S, mentre EA-1mA ha mostrato una tendenza all'aumento, sebbene non abbia raggiunto la significatività statistica. Entrambi i trattamenti hanno inibito l'aggregazione locale delle cellule infiammatorie. I risultati delle colorazioni IHC sono stati coerenti, mostrando una significativa infiltrazione di cellule infiammatorie nel gruppo BPCO. Dopo il trattamento con EA, il numero di macrofagi e linfociti T si è ridotto.

Cambiamenti nei fattori infiammatori e negli indicatori di stress ossidativo:

Nel gruppo BPCO, i livelli sierici di citochine pro-infiammatorie erano elevati, l'attività degli enzimi antiossidanti era ridotta e i livelli del prodotto della perossidazione lipidica MDA erano aumentati. Il trattamento con EA-3mA ha ridotto significativamente i livelli di IL-6, IL-1β e TNF-α, mentre ha aumentato il livello di IL-10. Ha inoltre migliorato l'attività della SOD. Inoltre, ha aumentato l'attività della SOD e della GSH-Px nel siero e nel tessuto polmonare e ha ridotto i livelli di MDA. Il trattamento con EA-1mA ha avuto un effetto minore sui livelli di citochine, con solo un miglioramento degli indicatori antiossidanti nel siero.

3.2 Risultati dell'analisi trascrittomica

Screening dei geni differenzialmente espressi:

L'analisi RNA-Seq ha identificato un totale di 1.101 geni differenzialmente espressi (DEG). Il clustering gerarchico ha mostrato modelli di espressione genica distinti tra il gruppo BPCO e il gruppo NC, con il gruppo EA-3mA che ha mostrato una maggiore somiglianza con il gruppo NC, mentre il gruppo EA-1mA ha mostrato una maggiore divergenza. L'analisi del diagramma di Venn ha rivelato che, rispetto al gruppo BPCO, il gruppo EA-1mA ha upregolato 94 geni e il gruppo EA-3mA 255 geni, con 32 geni sovrapposti. Inoltre, 63 geni upregolati nel gruppo BPCO rispetto al gruppo NC sono stati regolati in modo inverso dopo il trattamento con EA. Sono stati identificati anche geni specifici espressi solo in alcuni gruppi EA, come Msr1 e Slc26a4, che sono stati downregolati solo nel gruppo EA-1mA, e Pde3a e Bmp6, che sono stati upregolati solo nel gruppo EA-3mA.

Analisi di annotazione funzionale:

L'analisi dell'arricchimento dei percorsi GO e KEGG ha rivelato che i DEG nel gruppo BPCO erano principalmente arricchiti nelle cascate del complemento e della coagulazione, nel fagosoma, nel ritmo circadiano e in altri percorsi. Anche il gruppo EA-3mA ha mostrato un arricchimento in queste vie e, inoltre, ha mostrato un arricchimento specifico nelle vie della sinapsi colinergica, della sinapsi glutammatergica e della guida assonale. Il gruppo EA-1mA, rispetto al gruppo BPCO, ha arricchito soprattutto le vie associate all'infiammazione e alle risposte immunitarie, come la formazione della trappola extracellulare dei neutrofili, il fagosoma e le vie di segnalazione dell'hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1).

3.3 Risultati dell'analisi WGCNA

L'analisi WGCNA ha suddiviso i 1.101 DEG in 5 moduli. Il modulo MEblue era correlato negativamente con il rapporto FEV/FVC e i livelli sierici di SOD e positivamente con i livelli sierici di MDA. Questo modulo conteneva geni come Aqp9, Trem1, Mrc1 e Gpnmb, che erano downregolati in entrambe le intensità di EA. I moduli MEblue e MEbrown erano correlati negativamente con i livelli sierici di SOD, con Msr1 e Slc26a4 specificamente ripristinati nel gruppo EA-1mA. Il modulo MEturquoise era correlato negativamente con i livelli sierici di IL-1β e conteneva geni come Pde3a e Bmp6, che erano specificamente upregolati nel gruppo EA-3mA. I risultati della RT-qPCR e del WB hanno confermato che le tendenze di espressione di questi geni erano coerenti con i risultati del sequenziamento.

3.4 Selezione e analisi dei geni bersaglio

Sulla base dell'analisi e della revisione della letteratura, sono stati selezionati come geni target Mrc1, Gpnmb, Trem1 e Aqp9. Questi geni sono risultati significativamente upregolati nel modello di BPCO e downregolati in seguito al trattamento con EA. Essi possono partecipare alla patogenesi della BPCO modulando l'infiammazione, lo stress ossidativo e i processi di rimodellamento tissutale, rendendoli potenziali bersagli terapeutici per il trattamento della BPCO con EA.

4. Conclusioni della ricerca

Entrambe le intensità di stimolazione dell'elettroagopuntura, 1mA e 3mA, hanno indotto diversi pattern di espressione genica nel modello di ratto con BPCO, coinvolgendo percorsi di arricchimento sia condivisi che specifici. Geni come Mrc1, Gpnmb, Trem1 e Aqp9 possono servire come potenziali bersagli terapeutici, ma sono necessarie ulteriori ricerche per esplorare i loro ruoli funzionali nella BPCO. Questo studio fornisce prove trascrittomiche per una più profonda comprensione dei meccanismi molecolari alla base del trattamento con elettroagopuntura della BPCO.

Durante lo studio sono stati utilizzati diversi strumenti scientifici.

1. Sistema di esposizione integrale Tow-Int Tech (CSM-100C, Tow-Int Tech, Shanghai, Cina)

Viene utilizzato per esporre i ratti al fumo di sigaretta per la creazione del modello di ratto di BPCO.

Processo di creazione del modello di BPCO:

Impostazioni dei parametri dell'apparecchiatura:

Durante l'esperimento, i ratti sono stati collocati in una camera di esposizione, dove sono stati esposti a un ambiente controllato di fumo di sigaretta secondo un programma specifico.

Tempo e cicli di esposizione:

L'esperimento è durato 12 settimane, durante le quali i ratti sono stati esposti al fumo di sigaretta per 2 ore al giorno (in due sessioni di 1 ora). In totale, i ratti sono stati esposti al fumo di 30 sigarette. Ogni sigaretta conteneva 11 mg di catrame e 1,1 mg di nicotina.

Simulazione dell'ambiente patologico della BPCO:

Esponendo i ratti al fumo di sigaretta per un periodo prolungato, il modello ha imitato il processo patologico della BPCO causato dal fumo cronico nell'uomo. Le sostanze nocive contenute nel fumo di sigaretta hanno indotto infiammazione cronica e stress ossidativo nei polmoni dei ratti, portando a cambiamenti patologici polmonari simili a quelli osservati nei pazienti affetti da BPCO, come danni alveolari, infiammazione delle piccole vie aeree e ostruzione.

Aumento della risposta infiammatoria con l'iniezione di LPS:

In determinati momenti (giorni 1, 31 e 61), i ratti sono stati sottoposti a un'iniezione intratracheale di lipopolisaccaride (LPS). L'LPS, in quanto stimolante dell'infiammazione, ha potenziato ulteriormente la risposta infiammatoria polmonare, rendendo il modello di ratto più simile alle caratteristiche patologiche della BPCO umana. Questo approccio ha contribuito a stabilire un modello animale di BPCO più stabile e affidabile per le successive ricerche sugli effetti terapeutici e sui meccanismi dell'elettroagopuntura nel trattamento della BPCO.

2. Sistema di test della funzionalità polmonare animale:

Il sistema è utilizzato per valutare la funzione polmonare dei ratti, compresi il volume espiratorio forzato (FEV), la capacità vitale forzata (FVC) e altri indicatori, per valutare gli effetti dell'elettroagopuntura (EA) sulla funzione polmonare dei ratti affetti da BPCO.

Processo di analisi della funzione polmonare:

I ratti sono stati anestetizzati e sottoposti a tracheotomia. Il sistema è dotato di un ventilatore in grado di controllare automaticamente il modello di respirazione dell'animale, consentendo l'esecuzione di diversi test di funzionalità polmonare.

Parametri monitorati:

I parametri testati comprendono il volume espiratorio forzato a 0,1 secondi (FEV0,1), il volume espiratorio forzato a 0,3 secondi (FEV0,3) e la capacità vitale forzata (FVC). Il rapporto tra FEV e FVC (FEV/FVC) viene calcolato per valutare la funzione polmonare.

Questi parametri sono utilizzati per valutare lo stato della funzione polmonare dei ratti, aiutando a comprendere i cambiamenti della funzione polmonare nel modello di ratto con BPCO, nonché l'impatto delle diverse intensità di trattamento con elettroagopuntura sulla funzione polmonare.

Riferimento

Liu, Lu, et al. "Approfondimenti trascrittomici sulle diverse intensità di stimolazione dell'elettroagopuntura nel trattamento della BPCO in modelli di ratto" Journal of Inflammation Research (2024): 2873-2887.

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