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Aspartame: Una dolce trappola o un campo minato per la salute?

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Una ricerca dimostra che l'aspartame aumenta l'insulina attraverso il nervo vago, peggiora l'aterosclerosi e il knockout di Cx3cr1 è un nuovo bersaglio terapeutico.

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Recentemente, il team di ricerca guidato dall'accademico Cao Yihai del Karolinska Institute in Svezia ha collaborato con i team guidati dagli accademici Zhang Yun, Zhang Cheng e dal preside Chen Yuguo del Qilu Hospital dell'Università di Shandong. I ricercatori hanno pubblicato una ricerca intitolata "Sweetener aspartame aggravates atherosclerosis through insulin-triggered inflammation" sulla rivista Cell Metabolism. Lo studio evidenzia che l'aspartame può aggravare l'insorgenza dell'aterosclerosi e aumentare il rischio di malattie cardiovascolari. Sebbene i dolcificanti artificiali (come l'aspartame) possano limitare l'assunzione di zuccheri e ridurre l'accumulo di energia, perché causano malattie cardiovascolari legate all'accumulo di grassi?

Background della ricerca

Nel luglio 2023, l'Organizzazione Mondiale della Sanità ha classificato l'aspartame, uno dei dolcificanti artificiali più comuni, come cancerogeno di Gruppo 2B, il che ha scatenato una diffusa preoccupazione per i dolcificanti artificiali da parte di tutti i settori. Naturalmente, il gruppo 2B significa solo che è probabilmente cancerogeno per l'uomo e le prove della sua cancerogenicità per l'uomo sono limitate, quindi non c'è bisogno di farsi prendere dal panico eccessivo. Tuttavia, oltre al cancro, emergono costantemente associazioni tra i dolcificanti artificiali e altre malattie.

Obiettivi della ricerca

Questo studio si propone di esplorare l'associazione tra i dolcificanti artificiali (ASW), in particolare l'aspartame (APM), e le malattie cardiovascolari (CVD). Si concentra sull'analisi degli specifici meccanismi molecolari con cui l'APM influisce sull'aterosclerosi, fornendo una base teorica e potenziali bersagli terapeutici per la prevenzione e il trattamento delle malattie cardiovascolari.

Figura 1: Meccanismi molecolari specifici con cui l'APM influisce sull'aterosclerosi

Metodi sperimentali

Modelli di topo: Topi ApoE-/- e topi Cx3cr1 MΦ-/-/ApoE -/- double knockout, tutti alimentati con una dieta ad alto contenuto di grassi e colesterolo (HFCD)

Modello di scimmia cinomolgo: Sono state utilizzate scimmie cynomolgus maschio di quattro anni. All'acqua da loro bevuta sono stati aggiunti APM o saccarosio per simulare lo scenario dell'assunzione umana di dolcificanti. Sono state rilevate le variazioni di indicatori quali insulina, glucosio e C-peptide nel sangue per verificare se l'effetto dell'APM sulla secrezione di insulina riscontrato nel modello murino esiste anche nei primati, migliorando l'affidabilità e l'universalità dei risultati della ricerca.

Mezzi tecnici

Tecnologia di editing genico: Sono state utilizzate tecnologie come CRISPR-Cas9 per costruire modelli di topi modificati dal punto di vista genetico. Ad esempio, sono stati inseriti siti LoxP su entrambi i lati del gene Cx3cr1 e poi incrociati con topi Lyz2-Cre per eliminare il gene Cx3cr1 nei monociti/macrofagi e studiarne la funzione.

Tecniche di biologia molecolare: Il sequenziamento dell'RNA è stato utilizzato per analizzare il profilo di espressione genica delle PAEC stimolate dall'insulina per trovare potenziali molecole di segnalazione; la qPCR è stata utilizzata per misurare i livelli di mRNA di geni specifici (come Cx3cl1); il Western blot è stato utilizzato per rilevare l'espressione di proteine correlate (come CX3CL1 e CX3CR1) per esplorare i modelli di cambiamento delle molecole correlate quando l'APM influenza l'aterosclerosi.

Tecniche di biologia cellulare: La tecnica della coltura cellulare primaria è stata utilizzata per isolare e coltivare PAEC di topo e macrofagi primari per studi in vitro delle interazioni cellula-cellula e della trasduzione del segnale. Attraverso esperimenti in camera di flusso a piastre parallele ed esperimenti in camera di Boyden, sono state studiate l'adesione tra monociti e cellule endoteliali e la capacità di migrazione dei monociti per esplorare l'effetto della via di segnalazione CX3CL1-CX3CR1 sulle funzioni cellulari.

Tecniche di rilevamento metabolico: Il sistema di rilevamento del metabolismo energetico animale è stato utilizzato per misurare i parametri del metabolismo respiratorio dei topi, tra cui il consumo di ossigeno, la produzione di anidride carbonica, la produzione di calore, ecc. per valutare l'effetto metabolico complessivo dell'APM sui topi; il test di tolleranza al glucosio (GTT) e il test di tolleranza all'insulina (ITT) sono stati utilizzati per rilevare la sensibilità all'insulina dei topi per determinare se l'APM porta all'insulino-resistenza.

Sequenziamento di singole cellule: È stato utilizzato per analizzare le caratteristiche della popolazione e le differenze di espressione genica dei monociti del sangue periferico (PBMC) nei topi Cx3cr1 lox/lox e Cx3cr1 MΦ-/-, per comprendere a fondo i cambiamenti e i meccanismi d'azione delle diverse popolazioni cellulari durante il processo di APM che influisce sull'aterosclerosi.

Risultati sperimentali

1. L'APM esacerba l'aterosclerosi nei topi:

Dopo aver alimentato topi ApoE-/- con diverse dosi di APM per 12 settimane, le placche aterosclerotiche (AP) nell'aorta del gruppo alimentato con APM sono aumentate significativamente e hanno mostrato una relazione dose-dipendente. L'esperimento sul tempo ha mostrato che quando i topi sono stati alimentati con APM per 4 settimane, il numero di lesioni aterosclerotiche e la dimensione media delle placche sono aumentati, e sono ulteriormente aumentati a 8 settimane e a 12 settimane. Il gruppo di controllo alimentato con saccarosio al 15% non ha mostrato un evidente sviluppo di AP a 4 e 8 settimane, mentre l'effetto di promozione è apparso solo a 12 settimane. L'alimentazione con APM non ha influenzato il peso corporeo, la composizione della massa grassa, l'assunzione di cibo e la maggior parte dei parametri metabolici dei topi. Solo l'alimentazione con saccarosio ha aumentato leggermente il peso corporeo e la composizione della massa grassa dei topi, mentre le LDL sieriche sono leggermente diminuite.

Figura 2: L'APM aggrava l'aterosclerosi nei topi

2. L'APM aumenta i livelli plasmatici di insulina e regola l'insulina attraverso il nervo vago:topi:

Dopo aver alimentato i topi con diverse concentrazioni di APM, i livelli di insulina plasmatica sono aumentati significativamente entro 30 minuti. L'alimentazione continua con APM allo 0,15% per 12 settimane ha portato a un aumento continuo dei livelli di insulina nel siero e i topi hanno sviluppato insulino-resistenza. L'esperimento sulle scimmie cynomolgus ha anche dimostrato che dopo l'alimentazione con APM allo 0,15% o saccarosio al 15% per 10 minuti, i livelli di insulina sono aumentati transitoriamente a 30 minuti e sono tornati alla normalità a 60 minuti; i livelli di insulina nel gruppo APM e nel gruppo saccarosio erano simili, ma i cambiamenti nei livelli di glucosio nel sangue erano opposti. La vagotomia sottodiaframmatica bilaterale (SDV) è stata in grado di inibire completamente la produzione di insulina e l'aterosclerosi indotta dall'APM.

Figura 3: L'APM aumenta i livelli plasmatici di insulina e regola l'insulina attraverso il nervo vago

3. Studio meccanicistico dell'aterosclerosi insulino-dipendente:

Impianto di una micropompa a rilascio di insulina in topi ApoE-/- per simulare l'aumento dei livelli di insulina circolante nell'uomo. Dopo 4 settimane, la formazione, la crescita e l'instabilità delle AP sono state esacerbate, in modo simile all'effetto dell'alimentazione con APM. L'uso della streptozotocina (STZ) per eliminare la produzione di insulina pancreatica ha potuto contrastare completamente l'aumento della formazione, della crescita e dell'instabilità delle AP causate dall'APM, dimostrando che l'aumento dell'insulina è una condizione necessaria perché l'APM aggravi l'aterosclerosi.

Figura 4: Studio meccanicistico dell'aterosclerosi insulino-dipendente

4. CX3CL1 è una chemochina endoteliale arteriosa stimolata dall'insulina:

Dopo che l'insulina ha stimolato le cellule endoteliali aortiche primarie (PAEC) per 8 ore, l'analisi RNA-seq ha mostrato che Cx3cl1 era il gene più significativamente upregolato, e la qPCR e il Western blot hanno verificato l'elevata espressione del suo mRNA e della sua proteina. Gli esperimenti in vivo hanno dimostrato che i livelli di CX3CL1, sia circolanti che legati alla membrana delle cellule endoteliali vascolari, sono aumentati in modo significativo nei topi alimentati con APM, e questo aumento dipendeva dall'insulina.

Figura 5: CX3CL1 è una chemochina endoteliale arteriosa stimolata dall'insulina

5. Effetti chemiotattici e adesivi di CX3CL1-CX3CR1 sui monociti/macrofagi:

Nei monociti RAW264.7, la proteina CX3CR1 era altamente espressa. L'abbattimento di CX3CR1 con shRNA poteva inibire l'adesione dei monociti potenziati dall'insulina alle PAEC. L'esperimento in camera di flusso su piastra parallela ha mostrato che la stimolazione con insulina delle PAEC poteva aumentare l'adesione dei monociti e l'abbattimento di CX3CR1 poteva inibire questo effetto. Inoltre, la via di segnalazione CX3CL1-CX3CR1 potrebbe anche indurre la migrazione dei monociti e la polarizzazione dei macrofagi M0 in macrofagi M1.

Figura 6: Effetti chemiotattici e adesivi di CX3CL1-CX3CR1 su monociti/macrofagi

6. La delezione del gene Cx3cr1 riduce la popolazione di cellule mieloidi pro-infiammatorie:

Costruendo topi Cx3cr1 MΦ-/-, l'analisi di sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq) ha mostrato che la popolazione di cellule mieloidi era significativamente ridotta, le sottopopolazioni di monociti/macrofagi sono cambiate, la sottopopolazione Mono-c1 è diminuita e le sottopopolazioni Mono-c3 e Macro-c5 sono aumentate. L'analisi pseudo-temporale ha dimostrato che l'asse di segnalazione CX3CL1-CX3CR1 ha influenzato la differenziazione dei monociti.

Figura 7. scRNA-seq dei PBMC nei topi Cx3cr1MΦ-/-

7. La perdita di funzione del gene Cx3cr1 nei monociti/macrofagi contrasta l'aterosclerosi esacerbata da APM:

Rispetto al gruppo di controllo, l'aumento della formazione e della crescita di APM causata da APM è stato completamente contrastato nei topi con doppio knockout Cx3cr1 MΦ-/-/ApoE -/-. Nella fase iniziale (4 settimane) dello sviluppo delle AP, la delezione del gene Cx3cr1 ha inibito significativamente la formazione delle lesioni, mentre l'effetto anti-aterosclerotico è stato più evidente a 8 e 12 settimane.

Figura 8. La perdita genetica della funzione di Cx3cr1 nei monociti/macrofagi neutralizza l'aterosclerosi esacerbata da APM

Conclusioni della ricerca

Lo studio ha rilevato che l'aspartame può aumentare i livelli di insulina attivando il nervo parasimpatico, esacerbando così l'aterosclerosi; questo processo è insulino-dipendente e coinvolge la via di segnalazione CX3CL1-CX3CR1.

Il blocco specifico del gene Cx3cr1 nei monociti/macrofagi può contrastare l'aterosclerosi esacerbata dall'aspartame, fornendo un nuovo bersaglio per il trattamento delle malattie cardiovascolari correlate.

In questo studio, il sistema di metabolismo energetico animale è stato utilizzato per monitorare il consumo di ossigeno, la produzione di anidride carbonica, la produzione di calore e altri indicatori dei topi, fornendo un supporto di dati chiave per esplorare la relazione tra aspartame e aterosclerosi, indicando che il monitoraggio del metabolismo energetico svolge un ruolo importante nella ricerca sulle scienze della vita.

La nostra azienda, Tow-Int Tech, ha sviluppato in modo indipendente un sistema di rilevamento del metabolismo energetico animale, che può essere utilizzato per il monitoraggio e la registrazione in tempo reale degli indicatori metabolici e motori dei piccoli animali, e può misurare e analizzare qualitativamente e quantitativamente le attività comportamentali degli animali e le loro interazioni con il metabolismo respiratorio. Gli indicatori rilevati comprendono il consumo di ossigeno, la produzione di CO2, il rapporto di scambio respiratorio RER, il consumo energetico EE, l'assunzione di cibo, l'assunzione di acqua, il movimento tridimensionale XYZ, il peso corporeo, l'attività della ruota che corre e altri indicatori.

Riferimenti:

[1] Wu W, Sui W, Chen S, et al. Il dolcificante aspartame aggrava l'aterosclerosi attraverso l'infiammazione innescata dall'insulina[J]. Cell Metabolism, 2025.

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