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Uso della pletismografia del corpo intero per studiare e monitorare i meccanismi della tosse nei topi

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Pletismografia su tutto il corpo per la ricerca sul comportamento della tosse nei topi

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Astratto

La tosse è un meccanismo di difesa respiratoria essenziale che aiuta a eliminare il muco o le sostanze estranee dalle vie aeree. In condizioni normali, è una risposta fisiologica potente ed efficace. Tuttavia, negli stati patologici, i meccanismi neurali che controllano questi comportamenti difensivi possono diventare ipersensibili, portando a una tosse secca cronica che ha un grave impatto sulla qualità della vita. Sebbene la tosse sia un motivo comune per cui i pazienti cercano aiuto medico, i trattamenti attuali rimangono limitati e possono portare all'abuso di farmaci, in gran parte a causa di una comprensione insufficiente dei meccanismi neurali e molecolari alla base del comportamento della tosse.

Uno studio innovativo guidato dal team del professor Luo Fujun del Guangzhou Laboratory, pubblicato su eLife, ha identificato un circuito del tronco encefalico che controlla i comportamenti di difesa delle vie aeree simili alla tosse nei topi. Il primo autore, il professor Xu Xiaoshan, ha utilizzato un modello di topo che si muove liberamente per rivelare il circuito neurale del tronco encefalico che media i riflessi respiratori evocati, definendolo come una risposta simile alla tosse. Utilizzando molteplici tecniche di mappatura e modulazione dei circuiti neurali, il team ha scoperto un ruolo finora sconosciuto del nucleo trigeminale spinale caudale (SP5C) nel comportamento riflessivo della tosse.

Questo studio ha combinato la pletismografia dell'intero corpo (WBP), la registrazione audio e le tecnologie di tracciamento video sviluppate da Tow-Int Tech per stabilire un paradigma quantitativo per studiare il comportamento della tosse nei topi svegli. Utilizzando topi transgenici TRAP2 e la fotometria a fibre ottiche in vivo, i ricercatori hanno dimostrato che l'attività neurale in SP5C è altamente correlata alle risposte alla tosse indotte da agenti tussivi.

Ulteriori esperimenti hanno dimostrato che l'inibizione dell'output sinaptico di SP5C o la soppressione della sua attività con metodi chemiogenetici eliminano efficacemente questi riflessi della tosse. Al contrario, la stimolazione optogenetica dei neuroni eccitatori di SP5C o delle loro proiezioni al gruppo respiratorio ventrale (VRG) ha innescato robusti comportamenti simili alla tosse anche in assenza di stimoli tussivi.

In particolare, l'aumento prolungato dell'eccitabilità dei neuroni SP5C ha portato alla tosse cronica spontanea nei topi. Questi risultati forniscono una forte evidenza dell'esistenza di un circuito cerebrale precedentemente non identificato (SP5C→VRG) che controlla i comportamenti di difesa dalla tosse nei topi.

Obiettivi della ricerca

Questo studio ha identificato e convalidato sistematicamente il circuito neurale centrale che controlla il comportamento della tosse utilizzando un modello murino e diverse tecnologie di analisi dei circuiti neurali, con particolare attenzione al ruolo di SP5C.

Materiali e metodi

È stato utilizzato un approccio multidisciplinare per analizzare il comportamento della tosse dal punto di vista comportamentale, dell'attività neurale, della connettività circuitale e della modulazione funzionale.

3.1 Modelli animali
Per le manipolazioni specifiche del tipo di cellula sono stati utilizzati topi transgenici wild-type (WT), TRAP2, neurexina 1/2/3 knockout condizionale (Nrxn123 cTKO), VGluT2-IRES-Cre e GAD2-IRES-Cre.

3.2 Induzione e monitoraggio della tosse
Stimoli della tosse: acido citrico (CA), capsaicina e ammoniaca (NH₃) sono stati nebulizzati per indurre risposte simili alla tosse.
Sistema di monitoraggio: La pletismografia del corpo intero (WBP) ha registrato le variazioni del flusso d'aria respiratorio, mentre microfoni e telecamere hanno catturato i suoni e i movimenti della tosse per un'analisi quantitativa multimodale.
Definizione di tosse: Un evento simile alla tosse è stato definito dal caratteristico andamento trifasico del flusso d'aria "ispirazione-compressione-espirazione" nel WBP, accompagnato da suoni di tosse distinti.

3.3 Monitoraggio dell'attività neurale
Fotometria in vivo delle fibre: AAV-GCaMP6s è stato iniettato in regioni cerebrali target (ad esempio, SP5C, NTS, VRG) per monitorare i segnali di calcio e valutare le correlazioni temporali con il comportamento della tosse.

3.4 Convalida della necessità
Blocco dell'output sinaptico: AAV-Cre è stato iniettato in SP5C di topi Nrxn123 cTKO per bloccare condizionatamente la trasmissione sinaptica.
Inibizione chemiogenetica: AAV-hM4Di-mCherry è stato iniettato in SP5C e la cloroclozapina (DCZ) è stata somministrata per via intraperitoneale per inibire l'attività neuronale.

3.5 Validazione della sufficienza
Attivazione optogenetica: AAV-ChrimsonR è stato iniettato in SP5C per stimolare i neuroni eccitatori (CaMKII+). L'attivazione specifica della proiezione è stata ottenuta iniettando AAV-Cre in SP5C e AAV-DIO-ChrimsonR in VRG.

3.6 Tracciamento del circuito
Tracciamento trans-sinaptico anterogrado e retrogrado:
Anterogrado: AAV-hSyn-EGFP è stato iniettato in SP5C per visualizzare le proiezioni assonali.
Retrogrado: Il virus della pseudorabbia (RV) è stato iniettato in VRG per etichettare i neuroni monosinaptici in ingresso da SP5C.
Strategia a doppio virus: AAV2/1-Cre (anterogrado) e AAV2/9-DIO-Chrimson-mCherry sono stati utilizzati per confermare le connessioni sinaptiche dirette tra SP5C e VRG.

3.7 Modello di tosse cronica
NaChBac, un canale del sodio voltaggio-gato batterico, è stato sovraespresso in SP5C per aumentare l'eccitabilità neuronale e indurre la tosse spontanea.

3.8 Registrazione elettrofisiologica
Sono state eseguite registrazioni patch-clamp a cellule intere su fette acute di tronco encefalico per esaminare le proprietà neuronali di SP5C (ad esempio, accensione del potenziale d'azione, resistenza di membrana).

Risultati

4.1 Costituzione e convalida del modello di comportamento della tosse
NH₃, CA e capsaicina hanno indotto risposte tipiche della tosse, caratterizzate da un modello di flusso d'aria trifasico e da suoni di tosse distinti. L'NH₃ è stato scelto come stimolo tussivo primario per i suoi effetti forti e coerenti.

I trattamenti di controllo (soluzione salina) hanno prodotto una tosse trascurabile, confermando la specificità del modello.

4.2 L'attività neurale di SP5C è altamente correlata alla tosse
L'etichettatura TRAP2 ha mostrato che la stimolazione di NH₃ attivava i neuroni di SP5C, NTS e VRG. La fotometria a fibre ottiche ha confermato che i segnali di calcio dell'SP5C aumentavano significativamente durante gli eventi di tosse ed erano sincronizzati con i tempi della tosse.

4.3 SP5C è necessario per il riflesso della tosse
Il blocco dell'output sinaptico in SP5C di topi Nrxn123 cTKO ha ridotto significativamente la tosse indotta da NH₃. L'inibizione chemiogenetica dei neuroni SP5C ha soppresso fortemente le risposte alla tosse, mentre i controlli non ne hanno risentito.

4.4 L'attivazione di SP5C provoca direttamente la tosse
L'attivazione optogenetica dei neuroni VGluT2+ o GAD2+ ha alterato solo il ritmo respiratorio senza indurre la tosse. Al contrario, la stimolazione dei neuroni eccitatori CaMKII+ in SP5C ha innescato robusti comportamenti simili alla tosse senza stimoli tussivi.

4.5 SP5C regola la tosse attraverso proiezioni dirette al VRG
Gli esperimenti di tracciamento hanno rivelato proiezioni dirette da SP5C a cVRG, rVRG e preBötC. Il tracciato virale retrogrado ha confermato connessioni monosinaptiche tra SP5C e VRG. L'attivazione optogenetica delle proiezioni SP5C→VRG ha indotto la tosse, con una stimolazione ad alta frequenza più efficace.

4.6 L'aumento dell'eccitabilità di SP5C induce la tosse cronica spontanea
La sovraespressione di NaChBac in SP5C ha portato a tosse spontanea entro 3-4 giorni, con frequenza crescente nel tempo. Questi topi hanno anche mostrato una maggiore sensibilità all'NH₃, con risposte alla tosse più forti e più rapide. Le registrazioni elettrofisiologiche hanno confermato una maggiore eccitabilità e potenziali d'azione spontanei nei neuroni SP5C.

Conclusioni

Questo studio ha identificato e validato sistematicamente il circuito neurale centrale che controlla il comportamento della tosse nei topi, evidenziando il ruolo critico di SP5C.

I risultati principali includono:
- **SP5C è un nucleo centrale chiave per il riflesso della tosse**: La sua attività neurale è sincronizzata con la tosse, la sua inibizione elimina la tosse e la sua attivazione la scatena.
- **L'SP5C regola direttamente il VRG attraverso connessioni monosinaptiche**: Questa via costituisce la base neurale per la produzione motoria della tosse.
- **L'ipereccitabilità dell'SP5C causa la tosse cronica**: L'aumento dell'eccitabilità neuronale di SP5C induce tosse spontanea e ipersensibilità alla tosse, fornendo indicazioni sui meccanismi della tosse cronica.
- **I topi sono un modello valido per studiare i meccanismi neurali della tosse**: Le tecnologie multimodali hanno confermato l'affidabilità del comportamento dei topi simile alla tosse, supportando l'uso dei topi nella ricerca sui circuiti neurali.

**Significato e prospettive**
Questo studio rivela un centro regolatore della tosse (SP5C) precedentemente trascurato e offre nuove conoscenze meccanicistiche sulla tosse cronica e sull'ipersensibilità alla tosse. Potrebbe aprire la strada allo sviluppo di terapie antitosse mirate a livello centrale.

riferimento】

Xu X, Nie X, Zhang W, et al. Un circuito del tronco encefalico controlla i comportamenti di difesa delle vie aeree simili alla tosse nei topi. *bioRxiv*, 2024: 2024.09.08.611924.