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La metilazione è importante

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Guida per principianti al sequenziamento con bisolfito

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Parliamo di epigenetica! Poiché l'argomento è piuttosto vasto, ci concentreremo su un metodo standard per lo studio della metilazione del DNA: il sequenziamento con bisolfito. In questo post spiegheremo come funziona il sequenziamento con bisolfito, perché è importante in campi come la ricerca sul cancro e la biologia dello sviluppo e cosa lo rende una pietra miliare nello studio dell'epigenoma.

Cos'è il sequenziamento con bisolfito?
Il sequenziamento con bisolfito è il metodo standard per lo studio della metilazione del DNA. La metilazione è un marcatore epigenetico chiave: un'etichetta chimica aggiunta al DNA, di solito in corrispondenza delle basi di citosina (la "C" del codice del DNA). Non modifica la sequenza del DNA in sé, ma influisce sul modo in cui i geni vengono espressi, svolgendo ruoli cruciali nello sviluppo, nelle malattie e nella risposta all'ambiente. Il trattamento con bisolfito converte chimicamente le citosine non metilate in uracili (che vengono letti come timina "T" dopo la PCR), mentre le citosine metilate rimangono invariate in quanto chimicamente resistenti a questa conversione in condizioni standard. Sequenziando il DNA dopo questo trattamento e confrontandolo con il genoma di riferimento, possiamo individuare esattamente quali citosine erano originariamente metilate nel campione.

Perché è importante il sequenziamento con bisolfito?
È importante per la ricerca di base in quanto è responsabile della definizione dell'identità cellulare durante lo sviluppo, della regolazione dell'espressione genica specifica dei tessuti e dei modelli di metilazione coinvolti nell'inattivazione del cromosoma X e nell'imprinting genomico. Ma è anche rilevante dal punto di vista clinico, poiché modelli aberranti di metilazione del DNA sono collegati a molte malattie umane, in particolare al cancro, dove possono silenziare i geni soppressori del tumore o attivare gli oncogeni. La comprensione di questi schemi ci aiuta a capire i meccanismi delle malattie, a sviluppare biomarcatori diagnostici e potenzialmente a trovare nuovi bersagli terapeutici. È inoltre fondamentale per la biologia dello sviluppo, la ricerca sull'invecchiamento e la comprensione di come i fattori ambientali influenzino i nostri geni.

Come funziona il sequenziamento con bisolfito?
Il flusso di lavoro principale prevede alcune fasi fondamentali. Innanzitutto, si isola il DNA dal campione. Poi si passa alla fase cruciale della conversione del bisolfito: si tratta il DNA con bisolfito di sodio in condizioni specifiche per convertire le citosine non metilate in uracili. Dopo la conversione, il DNA è piuttosto fragile e frammentato. La fase critica successiva è l'amplificazione PCR per generare materiale sufficiente per il sequenziamento. È necessario amplificare con precisione questi frammenti di DNA convertiti. Infine, la libreria amplificata viene sequenziata e vengono utilizzati strumenti bioinformatici per allineare le letture al genoma di riferimento e determinare lo stato di metilazione in ogni posizione della citosina.

Quali sono le sfide del sequenziamento con bisolfito?
Questo metodo presenta alcune sfide che devono essere prese in considerazione. In primo luogo, il trattamento con bisolfito è di per sé duro e degrada una parte significativa del DNA, portando spesso a rese basse e richiedendo quantità di input più elevate. In secondo luogo, il processo di conversione può essere incompleto, lasciando alcune citosine non metilate non convertite, il che porta a chiamate di metilazione falso-positive. In terzo luogo, e molto importante per la fase di PCR, il modello di DNA contiene ora uracili. Le polimerasi del DNA standard ad alta fedeltà - gli enzimi utilizzati per una PCR accurata - spesso si bloccano o si interrompono quando incontrano basi di uracile, in quanto le riconoscono come un danno. Questo porta a un'amplificazione distorta, ovvero alcuni frammenti si amplificano molto meglio di altri, alterando i risultati e rendendo difficile rappresentare con precisione il profilo di metilazione originale, soprattutto se si tratta di campioni a basso input.

Come superare il bias di amplificazione dovuto agli uracili?
In passato i ricercatori dovevano scegliere: utilizzare una polimerasi non proofreading, in grado di leggere gli uracili, ma che commetteva più errori, oppure una polimerasi proofreading (ad alta fedeltà), precisa ma che si bloccava sugli uracili, con conseguenti bias e basse rese. È qui che i progressi della tecnologia enzimatica diventano fondamentali. Noi di Solis BioDyne abbiamo riconosciuto questa sfida e abbiamo sviluppato una nuova DNA polimerasi ad alta fedeltà appositamente studiata per superare questo problema.

Qual è la soluzione di Solis BioDyne?
Abbiamo recentemente lanciato la nostra nuova polimerasi HiFi, la Solis HiFi Hot Start DNA Polymerase. Questa polimerasi presenta alcune modifiche esclusive nella tasca di legame dell'uracile dell'enzima e, a differenza degli enzimi HiFi standard, legge in modo efficiente le basi uracili nel filamento del templato senza entrare in stallo, pur mantenendo un'elevata precisione grazie alla sua capacità di correzione. In questo modo si risolve direttamente il problema del bias di amplificazione nei flussi di lavoro di sequenziamento con bisolfito. I ricercatori possono ora ottenere un'amplificazione ad alta fedeltà del DNA convertito con bisolfito, che porta a una profilazione della metilazione più accurata, a una migliore complessità della libreria e a risultati affidabili anche da campioni a basso input o degradati, come quelli spesso utilizzati nella ricerca clinica. Questo affronta direttamente il problema del bias di amplificazione, consentendo un'amplificazione più uniforme del DNA convertito con bisolfito, che si traduce in dati di qualità superiore, migliore complessità della libreria e maggiore sensibilità da campioni a basso input. Sebbene sul mercato esistano altri enzimi HiFi in grado di tollerare i nucleotidi uracile, i clienti che hanno testato la polimerasi Solis HiFi nei flussi di lavoro di sequenziamento con bisolfito hanno già ricevuto un feedback positivo e ci auguriamo che questo sia uno strumento prezioso per i ricercatori in questo campo.