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Estrazione e purificazione dell'acido nucleico

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Estrazione e purificazione dell'acido nucleico

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1. Introduzione all'estrazione e purificazione dell'acido nucleico

L'estrazione dell'acido nucleico è una parte fondamentale della biologia molecolare, perché l'acido nucleico di alta qualità è essenziale per le applicazioni di biologia molecolare.

Riassumeremo alcune delle tecniche di estrazione dell'acido nucleico attualmente utilizzate e consigli sulla scelta del metodo di estrazione corretto per il tipo di campione; citeremo anche la valutazione della concentrazione e della qualità dell'acido nucleico, così come i problemi comuni nel processo di estrazione dell'acido nucleico.

a. Perché è necessaria l'estrazione dell'acido nucleico?

L'estrazione dell'acido nucleico fornisce risposte a un gran numero di ricerche e applicazioni estese (per esempio: clonazione, qRT-PCR e tecnologia di sequenziamento di prossima generazione nel campo del genoma intero e del trascrittoma), e l'acido nucleico ottenuto può essere utilizzato in una varietà di modi.

Lo scopo esatto della ricerca determina il tipo di acido nucleico da estrarre; l'applicazione dell'acido nucleico spesso influenza la scelta del metodo di estrazione. (Per esempio: la reazione standard End-point PCR non richiede la stessa qualità di DNA di un esperimento di sequenziamento dell'intero genoma)

Per determinare il metodo di ricerca, è necessario avere una chiara comprensione delle applicazioni a valle degli acidi nucleici e delle potenziali limitazioni legate al tipo di campione. (Per esempio, la raccolta di campioni clinici è spesso limitata e l'estrazione dell'acido nucleico presenta delle sfide)

Anche se il metodo di lisi cellulare è diverso a seconda del tipo di campione, il principio fondamentale dell'estrazione dell'acido nucleico nel suo complesso rimane lo stesso: i campioni di cellule o tessuti vengono lisati per rimuovere i contaminanti non nucleici (per esempio, le proteine, ecc.).

Motivi per estrarre l'acido nucleico:

①Per analizzare l'espressione genica nella ricerca di base e nella ricerca sulle malattie;

②Tracciare la risposta al trattamento farmacologico (per esempio, monitorare il titolo del virus durante e dopo il trattamento antivirale).

③Identificare nuove specie e comprendere il processo evolutivo (per esempio, analisi del DNA antico).

④ Monitorare e classificare gli agenti patogeni che causano focolai di malattie infettive nell'uomo, negli animali e nelle piante.

⑤ Monitorare la sicurezza degli alimenti e dell'acqua attraverso test microbiologici e monitoraggio quantitativo.

⑥Diagnosticare malattie (come malattie genetiche, cancro, difetti immunologici).

b. Metodo di lisi cellulare

La lisi cellulare dipende in gran parte dal tipo di campione, e i tessuti più forti, come le piante, richiedono più forza per essere trattati rispetto ai mammiferi.

I metodi di lisi cellulare si dividono in tre categorie: lisi meccanica, lisi enzimatica e lisi chimica.

I principi di base dei tre metodi di analisi e i vantaggi e gli svantaggi di ciascun metodo sono i seguenti:

Metodo 1: Lisi meccanica

Lisi meccanica: La membrana cellulare viene distrutta da una forza esterna.

Vantaggio:

Alta efficienza e velocità;

La lisi veloce accorcia il tempo dalla raccolta del campione all'isolamento dell'acido nucleico, che può essere cruciale negli esperimenti di analisi dell'espressione genica;

Ideale per campioni difficili da sciogliere (per esempio, materiale vegetale, funghi filamentosi e lievito).

Svantaggi:

A seconda del metodo utilizzato, l'elaborazione di più campioni richiede tempo (per esempio, l'elaborazione manuale della macinazione);

L'elaborazione di un gran numero di campioni richiede tempo e può aumentare il rischio di degradazione del campione;

L'elaborazione meccanica genererà calore nel campione, portando all'aggregazione delle proteine e alla degradazione dell'acido nucleico; l richiede alcuni strumenti o attrezzature speciali.

Metodo 2: Lisi enzimatica

Aggiungere un enzima per digerire le proteine o le strutture cellulari, come le pareti cellulari del lievito e i funghi filamentosi.

Vantaggio:

Il metodo ideale in laboratorio, senza attrezzature meccaniche di cracking nel processo;

Rimuovere selettivamente la parete cellulare, lasciando la parte cellulare per utilizzare un altro metodo di lisi (di solito la lisi chimica), il metodo è flessibile, e alcuni danni causati dalla lisi meccanica sono evitati.

Svantaggi:

Richiede tempo (la digestione enzimatica può richiedere 1 ora) ed è costosa;

Poiché i cambiamenti cellulari indotti dall'enzima possono influenzare l'espressione genica, non è adatto all'analisi dell'espressione genica.

Metodo 3: Lisi chimica

Nel processo di decomposizione chimica, le cellule vengono lavate con un detergente che può rompere le membrane lipidiche, rilasciando così i componenti cellulari. Oltre ai detergenti, i buffer di lisi chimica contengono solitamente sali caotropici, come il cloridrato di guanidina o l'urea, che aiutano a degradare la stabilità delle proteine dell'acido nucleico appena esposte (come le nucleasi) e legano gli acidi nucleici alla matrice di silice. La composizione esatta del tampone di lisi chimica dipende dalla direzione di applicazione e dal tipo di campione.

Vantaggio:

Il prezzo è economico, l'operazione è semplice e la velocità è elevata; non sono richieste attrezzature speciali.

Svantaggi:

I detergenti che distruggono le membrane cellulari di solito dissolvono anche altre membrane cellulari, liberando così i loro componenti. Questo metodo non è adatto per l'estrazione di acidi nucleici organelli-specifici;

Sebbene questa tecnologia sia efficace contro l'E. coli, non è efficace contro i batteri Gram-positivi, le cellule vegetali o le cellule fungine a causa della dura parete cellulare che impedisce al detergente di entrare nella membrana cellulare;

L'aggiunta contemporanea di detergente e sale caotropico ai campioni di E. coli può influenzare la capacità di distinguere il DNA plasmidico e il DNA genomico. Tuttavia, possono essere prese misure per distinguere questi tipi, che saranno discusse più avanti.

Le sostanze chimiche possono essere pericolose per i ricercatori.

c. Comprensione dei principi di purificazione dell'acido nucleico

Dopo che la cellula è lisata, l'acido nucleico viene selettivamente rilasciato dai componenti cellulari circostanti e concentrato in una soluzione acquosa o in una soluzione tampone adatta per il successivo utilizzo. Le fasi successive alla comprensione della cellula sono indicate collettivamente come purificazione. Poiché le proprietà chimiche dell'acido nucleico isolato rimangono invariate, indipendentemente dal tipo di campione che segue, la strategia di purificazione descritta di seguito è generalmente applicabile a tutti i tipi di campione.

colonne di spin ①

Questo metodo è di solito strettamente legato al kit. L'estrazione e la purificazione su colonna di spin possono ottenere rapidamente DNA, plasmidi, RNA e prodotti PCR di alta qualità senza la necessità di preparare nuovi reagenti. La colonna di spin contiene una matrice solida di gel di silice o resina proprietaria per il legame selettivo degli acidi nucleici.

Fasi tipiche dell'operazione di estrazione con colonna di spin:

A. Mantenere il campione lisato sulla colonna di spin:

Il campione lisato viene raccolto in un tampone legante contenente sali caotropici e posto su una colonna di spin. Il tampone legante permette all'acido nucleico di essere separato dalla soluzione acquosa e legato alla matrice della colonna.

B. Legame dell'acido nucleico:

La centrifugazione porta l'intero campione a contatto con la matrice della colonna. Gli acidi nucleici nel campione si legano selettivamente alla colonna, mentre gli altri componenti cellulari passano attraverso la matrice della colonna.

C. Lavaggio:

Dopo il legame, la colonna viene pulita per rimuovere qualsiasi contaminante residuo, come proteine o sali residui, che possono seriamente influenzare le applicazioni a valle. Il numero di lavaggi dipende dal kit. Alcuni buffer di lavaggio contengono sali caotropici per rimuovere le proteine, e alcuni buffer contengono alte concentrazioni di etanolo per rimuovere i sali. La maggior parte dei kit include quasi interamente un tampone composto da etanolo come fase di lavaggio per assicurare una desalinizzazione completa.

D. Rimozione dell'etanolo residuo dalla colonna di spin:

Dopo il lavaggio, a volte viene eseguito un breve periodo di centrifugazione a vuoto per rimuovere l'etanolo residuo.

E. Eluizione:

Per eluire gli acidi nucleici dalla matrice, aggiungere una piccola quantità di acqua o di tampone di eluizione* e lasciare riposare la colonna per alcuni minuti. Dalla fase precedente, il sale caotropico è stato rimosso e il tampone di eluizione può reidratare l'acido nucleico e separarlo dalla matrice della colonna. Una centrifugazione può trasferire la soluzione acquosa contenente il campione di acido nucleico in una nuova provetta da centrifuga.

*Gli acidi nucleici sono solitamente conservati in un tampone contenente Tris e EDTA (tampone TE). La presenza di EDTA aiuta a inibire l'attività della nucleasi. Anche se il tampone TE è efficace nell'inibire le nucleasi, il contenuto di EDTA nel TE è di solito diversi ordini di grandezza inferiore al contenuto di Mg2+.

Vantaggi e svantaggi delle colonne di spin:

Vantaggio:

basso costo

Efficiente e affidabile

Producono acidi nucleici adatti ad applicazioni downstream

Svantaggi:

I ceppi a crescita lenta hanno bassi livelli di acido nucleico

L'eluizione incompleta porta alla perdita di acido nucleico

La capacità di legame della colonna di spin determina la quantità totale di acido nucleico

Kit di colonne di spin per plasmidi

I kit di estrazione dei plasmidi possono isolare rapidamente i plasmidi da E. coli e sono uno dei kit più utilizzati nei laboratori di biologia molecolare.

Poiché E. coli è facile da lisare chimicamente, il kit per plasmidi combina la lisi del campione e la purificazione dell'acido nucleico come segue:

A. Le cellule batteriche vengono lisate in una provetta da centrifuga prima che i detriti cellulari vengano centrifugati e precipitati;

B. La configurazione del tampone di lisi è tale che solo il DNA plasmidico può essere combinato con la colonna di spin dopo la lisi. Pertanto, il lisato cellulare può essere immediatamente montato sulla colonna mediante centrifugazione.

C. Combinare il plasmide contenente il lisato con la colonna di spin, e le restanti fasi di purificazione sono simili a tutti gli altri schemi di colonna di spin.

D. Utilizzare DNA plasmidico di alta qualità per l'eluizione in acqua o in tampone TE.

**La maggior parte dei kit per colonne di spin distingue il DNA plasmidico dal DNA genomico (gDNA) durante il processo di lisi. Il tampone di lisi contiene idrossido di sodio e laurilsolfato di sodio per denaturare completamente il plasmide e il gDNA. Nella fase successiva, il campione viene neutralizzato e il DNA plasmidico rinasce. Tuttavia, il gDNA ad alto peso molecolare non può essere completamente ricombinato e si impiglia facilmente con le proteine del campione, impedendo così al gDNA di legarsi alla colonna di spin, portando alla sua rimozione. Anche se in termini di efficienza e affidabilità, i kit di colonne di spin per plasmidi hanno alcune carenze. Lo standard di ottimizzazione del kit è principalmente attraverso i ceppi di Escherichia coli, ceppi lenti o instabili possono avere basse rese. Inoltre, i kit per plasmidi e i kit di spin column hanno una capacità di legame limitata. A seconda del kit, il tasso di recupero totale è compreso tra 50 e 100 μg.

Altri kit con colonna di spin

Oltre all'estrazione dell'acido nucleico, le colonne di spin vengono utilizzate anche per la purificazione e la concentrazione dell'acido nucleico. I kit di purificazione possono essere utilizzati per rimuovere i reagenti residui non reagiti nella PCR o in altre reazioni di preparazione degli enzimi e per purificare il DNA dai gel di agarosio. I campioni concentrati possono fornire una maggiore flessibilità per molte applicazioni a valle.

Alcuni kit commerciali di colonne di spin hanno la funzione di screening dei frammenti, consentendo la selezione di kit adatti alla gamma di frammenti (per esempio, piccoli RNA) in base allo scopo della ricerca. Questo si ottiene cambiando il contenuto di etanolo nella soluzione tampone.

Molti kit di colonne di spin combinano la lisi cellulare e la purificazione dell'acido nucleico. Possiamo trovare colonne di spin per la separazione dell'acido nucleico da quasi ogni tipo di campione, inclusi, ma non limitati a, insetti, piante, semi, funghi, batteri, saliva, sangue, feci e campioni embrionati in paraffina.

② Precipitazione fenolo/cloroformio ed etanolo

Il metodo di estrazione fenolo/cloroformio è un metodo che si basa sul principio della diversa solubilità per separare gli acidi nucleici. Il campione viene esposto a un determinato rapporto di miscela fenolo/cloroformio per ottenere l'acido nucleico richiesto. Le proteine sono solubili con fenolo/cloroformio, l'acido nucleico è solubile in acqua. Quando la soluzione fenolo/cloroformio viene mescolata con il campione, la proteina e l'acido nucleico vengono separati, fornendo una garanzia per la purificazione.

Per la doppia estrazione di RNA e DNA, questo processo può essere regolato aggiungendo fenolo acido. Questo permette agli ioni H+ in eccesso di interagire con la spina dorsale del fosfato, ottenendo un DNA senza carica. Il DNA sarà dissolto nello strato di fenolo estratto da fenolo/cloroformio, mentre l'RNA rimarrà dissolto nella fase acquosa a causa della sua naturale acidità. Dopo la centrifugazione, le fasi acquosa e organica possono essere separate, e ogni fase può essere etanolo-precipitata.

Fasi operative della classica precipitazione fenolo/cloroformio ed etanolo:

A. Contatto di fenolo e cloroformio:

Il campione lisato viene solitamente mescolato con fenolo/cloroformio tramite un forte vortex. Il vortice assicura che tutti i componenti organici possano interagire completamente con la miscela fenolo/cloroformio per ottenere una completa dissoluzione e rimozione.

B. Centrifugazione: Dopo la fase A, sono visibili due fasi. La fase acquosa contenente acidi nucleici è in alto, mentre la fase organica in basso contiene proteine, lipidi e altre macromolecole. Quindi centrifugare il campione per separare completamente le due fasi

C. Separazione di fase: rimuovere attentamente la fase acquosa con una pipetta.

D. Precipitazione con etanolo: precipitazione e purificazione dell'acido nucleico con etanolo. Durante il processo di precipitazione con etanolo, vengono aggiunti sale ed etanolo per tamponare l'acido nucleico nella soluzione acquosa. Il sale tampona la spina dorsale di fosfato di zucchero e l'etanolo cambia la costante dielettrica della soluzione. Questo permette di separare l'acido nucleico dalla soluzione acquosa, che può essere separata mediante centrifugazione ad alta velocità.

E. Risospensione: Ridisciogliere il DNA o l'RNA in un cluster in acqua o tampone TE.

Vantaggi e svantaggi dell'estrazione con fenolo/cloroformio:

Vantaggi:

Alta efficienza, di solito superiore alla resa della colonna di spin; ü Adatto per l'estrazione di DNA completo ad alto peso molecolare (es., gDNA);

I campioni sospesi in soluzioni complesse di solito sono ancora adatti a questo metodo, e alcuni composti volatili possono interferire con la matrice della colonna di spin;

Per i campioni di grasso (es. tessuto cerebrale), l'estrazione con fenolo/cloroformio è migliore della maggior parte dei kit di colonne di spin.

Svantaggi:

Se non maneggiati correttamente, fenolo e cloroformio sono dannosi e devono essere maneggiati con estrema cura in una cappa aspirante.

Questo metodo richiede più tempo rispetto ai kit di spin column e può portare a rendimenti inferiori.

Le tracce di fenolo e cloroformio nell'estratto di acido nucleico avranno un impatto negativo sulle reazioni enzimatiche a valle, come la PCR. Se questo è il caso, deve essere eliminato prima della PCR. Pertanto, ci sono molti kit di purificazione con colonna di spin.

Potrebbe essere necessaria un po' di esperienza pratica per estrarre in modo sicuro la fase acquosa senza contaminanti.

③ Metodi automatici per aumentare la produttività

A seconda delle diverse applicazioni degli acidi nucleici e dei tipi di campione, è possibile selezionare i metodi di estrazione ad alta produttività più adatti. Il più comunemente usato è l'estrazione a microsfere magnetiche. In questa tecnica, le perle magnetiche caricate positivamente vengono introdotte nel campione, e il DNA si combina con le perle magnetiche caricate positivamente a basso pH, e il DNA viene rilasciato ad alto pH. Le perline possono essere rimosse da un magnete, e il pH della soluzione può essere facilmente regolato per separare l'acido nucleico desiderato. Questa tecnologia è veloce ed efficiente, ma l'investimento in attrezzature di automazione può essere piuttosto costoso. (Il materiale di rivestimento delle perline magnetiche è diverso e il principio è leggermente diverso)

d. Fattori chiave e loro impatto sull'estrazione

Quando si esegue l'estrazione o la purificazione dell'acido nucleico, è necessario prestare molta attenzione ad alcuni fattori, come il pH, la concentrazione di sale, la temperatura, il volume del tampone e la potenziale contaminazione da etanolo. Ognuno di questi fattori influenzerà notevolmente la resa, la qualità e la percentuale di successo degli esperimenti a valle.

1. Un pH o una concentrazione di sale non ottimali possono cambiare la carica dell'acido nucleico, facendo sì che l'acido nucleico non riesca a legarsi alla colonna di spin, o che il fenolo/cloroformio dissolva l'acido nucleico per errore.

2. Un volume errato del tampone può portare a una lisi incompleta, alla neutralizzazione o alla diluizione indiretta dell'acido nucleico eluito.

3. La contaminazione da etanolo può inibire le reazioni enzimatiche a valle e far galleggiare il campione fuori dal gel di agarosio.

e. Circostanze speciali

1. Estrazione di DNA ad alto peso molecolare

Per alcune applicazioni (come l'ibridazione Southern e alcuni processi di sequenziamento), è necessario estrarre DNA intatto ad alto peso molecolare (HMW). Per estrarre HMWDNA, oltre ai fattori di cui sopra, è necessario considerare altri fattori:

Il HMW-DNA si rompe facilmente durante il processo di estrazione. Perché le forze di taglio (vortice, ultrasuoni, ecc.) possono causare la decomposizione delle molecole di DNA, risultando in frammenti più corti dopo l'estrazione. Per evitare questo, applicare un taglio minimo al campione.

Per le applicazioni che richiedono la visualizzazione di HMWDNA, la lisi e l'estrazione possono essere eseguite in un tappo di gel di agarosio per stabilizzare il DNA durante l'intero processo (per esempio, elettroforesi su gel a campo pulsato), dove l'intero cromosoma rimane intatto e visualizzato dall'elettroforesi.

La lisi alcalina spesso porta alla perdita di HMW-DNA, perché HMW-DNA si aggroviglia irreversibilmente durante il processo di denaturazione.

Se usi una colonna di spin per estrarre HMW-DNA, considera la capacità di legame della matrice della colonna. Alcune colonne possono gestire solo frammenti di 10-15 kb, perché i frammenti più grandi sono difficili da eluire dalla colonna a causa dello stretto legame. Per i frammenti più grandi, potrebbe essere necessario considerare colonne dedicate con alto legame HMW, o metodi manuali come l'estrazione con fenolo/cloroformio e la precipitazione con etanolo.

2.SmallRNAs

Nel tradizionale processo di estrazione dell'RNA, le piccole molecole di RNA vengono spesso perse, perché le colonne di spin tradizionali hanno di solito un limite di dimensione di circa 100 coppie di basi, anche se il limite di dimensione dipende in gran parte dalla formulazione del buffer. Le piccole molecole di RNA sono estremamente importanti per la comprensione delle funzioni biologiche, quindi la maggior parte dei kit di estrazione e purificazione dell'RNA totale sono ottimizzati per catturare questi piccoli RNA.

2. Valutare l'acido nucleico estratto

a. Quantificazione e controllo di qualità

Dopo l'estrazione e la purificazione dell'acido nucleico, è molto importante capire la concentrazione e la qualità del campione estratto. A seconda dello scopo dell'esperimento a valle, le fluttuazioni di questi parametri possono cambiare notevolmente i risultati. Per esempio, se ogni reazione di sintesi di cDNA non usa esattamente lo stesso RNA totale, l'analisi di espressione qRT-PCR risulterà in dati inaffidabili. Ci sono molti metodi di valutazione degli acidi nucleici, che differiscono per consumo di tempo, costo e precisione. Infine, i requisiti degli esperimenti a valle dovrebbero essere considerati quando si selezionano i metodi.

Quella che segue è una panoramica di alcuni dei metodi di valutazione più comuni:

1. elettroforesi su gel di agarosio

L'elettroforesi su gel di agarosio si basa sul peso molecolare e separa gli acidi nucleici attraverso una matrice di gel solidificato in presenza di una corrente elettrica. L'acido nucleico estratto viene confrontato con uno standard di peso molecolare parallelo, che contiene frammenti di dimensioni e concentrazione note.

Vantaggi: ispezionare visivamente la qualità del DNA; i campioni di DNA genomico completo sono mostrati come bande complete; gli acidi nucleici degradati sono mostrati come diffusi; l'RNA ribosomiale è chiaramente visibile; disponibile per la maggior parte dei laboratori; visualizzazione di possibili contaminazioni (per esempio, campioni di purificazione del plasmide in cui è presente RNA).

Svantaggi: Viene fornita solo una stima approssimativa della concentrazione; non mostra la presenza di contaminanti, come il sale, nel campione.

2. Elettroforesi capillare

L'elettroforesi capillare, a volte indicata come un laboratorio su un chip, fa passare i campioni attraverso un piccolo capillare monitorato da un rilevatore, e il computer riceve le informazioni e le visualizza graficamente. L'elettroforesi capillare è adatta per analizzare la dimensione dei frammenti, la quantità e la qualità generale del campione. Questa tecnica è più accurata della tradizionale elettroforesi dell'agarosio, e di solito è un metodo di valutazione degli acidi nucleici prima della qPCR.

Vantaggi: analisi accurata di più tipi di acidi nucleici; il caricamento automatico del campione e la quantificazione sono più accurati del metodo del gel; alta sensibilità: campioni piccoli e di piccole dimensioni possono essere rilevati e analizzati.

Svantaggi: costoso.

3. Spettrofotometria

La spettrofotometria è una tecnica di rilevamento rapido che si basa sulle caratteristiche della luce che interagisce con il campione per una quantificazione accurata. Il campione viene caricato nello strumento di prova (spettrofotometro) con diverse lunghezze d'onda di luce che lo attraversano, e poi viene ricevuto dal rilevatore. Il rilevatore fornisce informazioni sulla quantità e qualità del campione, che vengono poi tradotte dal software del computer. Misurando l'assorbanza a 260nm e 280nm, il rapporto dei due indica la purezza del campione. Per DNA e RNA puri, il rapporto 260/280 dovrebbe essere compreso tra 1,8 e 2,1. Ulteriori misurazioni possono essere fatte a 230nm, e un rapporto 230/280nm inferiore a 2.0 indica la presenza di contaminanti organici.

Negli ultimi anni, un nuovo tipo di metodo di analisi spettrofotometrico basato sulla fluorescenza è stato ampiamente utilizzato nei laboratori di biologia molecolare. Questa tecnologia basata sulla fluorescenza ha una maggiore sensibilità rispetto alla spettrofotometria tradizionale e può distinguere il DNA e l'RNA utilizzando coloranti fluorescenti unici per DNA e RNA.

Vantaggi: accurato e veloce; fornisce informazioni sulla presenza di contaminanti; la maggior parte dei laboratori dispone di spettrofotometri.

Svantaggi: Incapace di quantificare un singolo segmento; costoso.

b. Migliorare la qualità dell'acido nucleico

Nonostante i nostri grandi sforzi, di solito è necessario prendere misure aggiuntive per migliorare la qualità degli acidi nucleici. Di seguito verranno descritti alcuni fattori aggiuntivi che devono essere considerati per migliorare la qualità degli acidi nucleici.

1. Temperatura di utilizzo e conservazione:

Gli acidi nucleici sono facilmente degradati dalle nucleasi (in particolare RNasi e DNasi), e la conservazione a bassa temperatura può aiutare a inibire l'attività enzimatica. Il DNA è intrinsecamente più stabile dell'RNA ed è più resistente all'attività delle nucleasi a temperature di conservazione più elevate.

Il DNA dovrebbe essere conservato a -20°C o meno, e tenuto sotto ghiaccio durante l'uso. Ripetuti congelamenti e scongelamenti possono frammentare il DNA, specialmente il HMW-DNA. Pertanto, se l'HMWDNA viene usato frequentemente, dovrebbe essere conservato a 4°C.

L'RNA viene degradato più facilmente dalle nucleasi e dovrebbe essere sempre conservato a una temperatura molto bassa (da -20 a -80°C) e scongelato solo se necessario.

2. Inibitore di nucleasi e soluzione di pulizia

La presenza di nucleasi può degradare rapidamente i campioni di acido nucleico. È facile trasferire le nucleasi da mani non protette alla superficie di lavoro; pertanto, è necessario indossare sempre i guanti quando si lavora con gli acidi nucleici.

Il posto di lavoro dovrebbe essere mantenuto pulito e frequentemente pulito con etanolo per rimuovere la contaminazione da nucleasi. Ci sono molti prodotti commerciali che possono prevenire la contaminazione da RNasi. Molti ricercatori aggiungono anche l'inibitore della ribonucleasi dietil pirocarbonato (DEPC) all'acqua per il lavoro sull'RNA. È anche consigliabile lavare e trattare la vetreria con EDPC prima di lavorare con l'RNA.

Negli ultimi anni, molti stabilizzatori di acido nucleico sono apparsi sul mercato. A differenza delle soluzioni di pulizia descritte sopra, questi reagenti vengono aggiunti direttamente al campione intatto nel punto di raccolta per inibire le nucleasi e stabilizzare gli acidi nucleici fino all'estrazione. Anche se la maggior parte di questi reagenti sono compatibili con la maggior parte dei kit e delle applicazioni di estrazione a valle, alcuni di essi devono essere rimossi dai campioni intatti prima dell'estrazione dell'acido nucleico.

3. Utilizzare materiali di consumo privi di nucleasi

Quando si usa qualsiasi acido nucleico, assicurarsi di nucleare qualsiasi materiale di consumo o vetreria. Quando possibile, compra provette e puntali per pipette senza nucleasi con filtri. Se dopo l'analisi, si scopre che la resa del DNA è bassa e la qualità non è ideale, o se il DNA estratto supera la valutazione della qualità, ma si ottengono risultati insoddisfacenti durante l'esperimento a valle, è necessario fare un po 'di risoluzione dei problemi.