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Sequenziare mentre si sintetizza

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il principio fondamentale di NGS

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NGS è il processo di frammentazione e splicing casuale del DNA per preparare una libreria di sequenziamento. Eseguendo reazioni di estensione sulle decine di migliaia di cloni della libreria, vengono rilevati i segnali corrispondenti e si ottengono infine informazioni sulla sequenza.

Il principio fondamentale di NGS è il sequenziamento mentre si sintetizza, come analizzato di seguito.

Ciclo 1: Aggiungere il sistema di reazione

Incorporare una base

Rimuovere altri nucleotidi non incorporati

Rilevamento del segnale

Ciclo 2 - n: Aggiungere il sistema di reazione, ripetere il ciclo 1

11. Quattro NTP marcati con fluorescenza vengono aggiunti ad ogni ciclo di reazioni di sequenziamento.

terminato con un gruppo di protezione che può essere rimosso.

2. Solo un nucleotide viene integrato in ogni ciclo di reazione e lo strumento legge il segnale di fluorescenza corrispondente.

3. Fine della lettura del segnale, rimozione chimica dei gruppi bloccanti e fluorescenti per il prossimo round di reazioni di sequenziamento.

Attualmente, Illumina è una delle aziende più utilizzate sul mercato, e la libreria preparata è attaccata a un chip speciale "Flowcell" tramite il principio dell'accoppiamento complementare delle basi, nei seguenti passi:

I. Flowcell 8 corsie, superficie interna → chimicamente modificata → 2 primer di DNA → complementari alla sequenza di splice della libreria di DNA da sequenziare → covalentemente legati alla Flowcell per evitare che venga lavata via dal liquido

II. Biblioteca di DNA: molti frammenti di DNA, uniti ad entrambe le estremità con una specifica giunzione di DNA per formare una miscela di DNA → due caratteristiche, metodo di produzione → ultrasuoni per interrompere il DNA genomico, entrambe le estremità con enzimi per riempire, utilizzando l'enzima Klenow per aggiungere una base A all'estremità 3', e poi ligasi per unire la giunzione → formare una libreria → miscela di DNA

III. Bridge PCR: seminare la libreria sul chip → ibridazione complementare (sequenze di DNA alle due estremità della libreria sono complementari ai primer sul chip) → aggiungere dNTP ed enzimi → generare un nuovo filamento → aggiungere soluzione alcalina NaOH → filamento di DNA non filato → lasciare il filamento originale → aggiungere liquido neutro per neutralizzare la soluzione alcalina → l'altra estremità del DNA si ibrida complementarmente con il secondo primer sulla piastra di vetro → aggiungere enzimi e dNTP → aggiungere alcali → aggiungere liquido neutro → ripetere il processo di amplificazione

IV. Trasformare la doppia catena sintetizzata in una catena singola che può essere sequenziata → reazione chimica → tagliare un gruppo specifico su un primer → la soluzione alcalina lava la catena rimanente del chip → aggiungere la soluzione neutra con il primer di sequenziamento (con dNTP marcato con fluorescenza → l'estremità 3' è bloccata da un gruppo azide → un ciclo può estendere solo una base, la polimerasi → seleziona il dNTP complementare alla base nella posizione originale) → rimuove il dNTP e gli enzimi in eccesso con acqua → mette la base sul microscopio per la scansione laser → determina il tipo di base (4 dNTP) in base alla fluorescenza emessa → aggiunge reagenti chimici per tagliare il gruppo azide e il gruppo fluorescente etichettato accanto ad esso → esporre il gruppo idrossile all'estremità 3' → aggiungere nuovi dNTP e nuovi enzimi → estendere nuovamente una base → eliminare l'eccesso di enzimi e dNTP → leggere il colore nella scansione laser → ripetere il processo

V. Indice: Marcatura sulla giunzione della libreria; la sequenza specifica sulla giunzione campione-specifica segna l'origine del campione

VI. Leggi indice: alcali unstranded read1 DNA → aggiungere soluzione neutra → aggiungere read2 primer di sequenziamento (sito di legame accanto alla sequenza indice) → eseguire 2 giri di sequenziamento (generalmente da 6 a 8 basi) → capire un segmento specifico di DNA da quale campione dell'originale

VII. Sequenziamento double-end: un filamento di DNA viene letto una volta in entrambe le direzioni avanti e indietro, raddoppiando la lunghezza effettiva del sequenziamento

VIII. Filo invertito: sintetizzare il filamento complementare di DNA → tagliare la radice del filamento originale con reagenti chimici → filamento complementare rimanente → eseguire un secondo sequenziamento (aggiungere primer read3 per leggere le basi)