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Test COVID-19

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Perché usare un tampone nasale più doloroso?

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Il test COVID-19 è ormai entrato nella nostra vita quotidiana, ma molte persone hanno ancora grandi domande sui principi del test degli acidi nucleici. Perché i test degli acidi nucleici richiedono l'uso di un tampone nasale? Qual è il motivo? Vediamo la questione dal punto di vista del principio.

La tecnica più comunemente utilizzata per i test degli acidi nucleici è la RT-PCR (Real-time Quantitative PCR, Real-time Polymerase Chain Reaction), chiamata anche qPCR (Quantitave Polymerase Chain Reaction), che è in realtà una tecnica molto matura nella pratica clinica. qPCR (RT-PCR) è attualmente il metodo preferito per la quantificazione del DNA/RNA nel campo della biologia molecolare.

A differenza della PCR convenzionale, la qPCR è un metodo in grado di quantificare in tempo reale, ovvero di monitorare l'esatta quantità di DNA amplificato nel campione in tempo reale. Tuttavia, nella PCR convenzionale, il DNA amplificato può essere rilevato solo dopo il completamento dell'amplificazione (rilevamento endpoint).

Prendendo come esempio il virus COVID-19, l'RNA virale può essere utilizzato come modello di amplificazione, trascritto inversamente in cDNA e quindi amplificato mediante qPCR.

Nella reazione qPCR, la PCR in fase di amplificazione viene marcata con un carburante fluorescente (comunemente SYBR GREEN I) e la fluorescenza viene rilevata durante tutto il processo qPCR (30-45 cicli). Più molecole di DNA sono presenti nel campione, più velocemente aumenta la fluorescenza durante il ciclo di PCR. L'intensità del segnale di fluorescenza della qPCR è proporzionale alla quantità iniziale di DNA, vale a dire che più virus sono presenti nel campione, prima verrà rilevata la fluorescenza nel ciclo. Il ciclo in cui è possibile rilevare il segnale di fluorescenza è chiamato punto di incrocio (Cq).

P2: L'immagine raffigura l'amplificazione qPCR (primi due cicli) che avviene in una provetta PCR. La qPCR ha diverse varianti della molecola di segnalazione e possono essere implementati diversi metodi per la sua etichettatura fluorescente. I due principi più comuni sono mostrati nella figura. La sezione di sinistra mostra la variante 5′-nucleasi, che utilizza il meccanismo FRET (trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza), in cui la fluorescenza del fluoroforo reporter (R) viene trasferita al quencher (Q) e non viene emessa finché R e Q sono insieme (come TaqMan). Quando i due sono delocalizzati (quando la sonda viene rimossa durante l'estensione della PCR dall'attività nucleasica 5′-de della TaqDNA polimerasi), la R è libera di fluorescere e può quindi essere rilevata. La sezione di destra rappresenta una variante della qPCR che utilizza la fluorescenza di intercalazione (ad es. SYBR Green). Vengono utilizzati speciali coloranti di intercalazione che aumentano fortemente la quantità di fluorescenza emessa ogni volta che vengono inseriti nel dsDNA.

P3: Sono mostrati i grafici di amplificazione per cinque campioni (S1- S5). Man mano che il DNA di ciascun campione viene amplificato, la fluorescenza aumenta per ogni ciclo. Nell'esempio precedente, il campione S1 contiene la quantità iniziale più elevata di DNA bersaglio, con conseguente aumento più rapido della fluorescenza. Il campione S4 contiene il numero più basso di molecole iniziali di DNA target, mentre S5 non contiene alcun DNA target.

In altre parole, più virus è presente nel tampone nasofaringeo, più è facile rilevare il nuovo coronavirus. Pertanto, nella pratica clinica, si applica un tampone nasale per garantire l'accuratezza e si ritiene che la cavità nasale contenga generalmente una carica virale più elevata.

Quindi, preferireste utilizzare un tampone nasale o un tampone faringeo? Diteci cosa ne pensate!