Scoprire il meccanismo di Ucp1 legato al BAT e all'obesità

Tow-Int Tech contribuisce a scoprire il meccanismo di regolazione della proteina disaccoppiante 1 (Ucp1) nel tessuto adiposo bruno (BAT), fornendo potenziali bersagli per il trattamento dell'obesità e delle malattie metaboliche.

Recentemente, ricercatori come Duo Su e Tingting Jiang hanno studiato il meccanismo di regolazione del gene Ucp1 nel tessuto adiposo bruno (BAT). Attraverso vari metodi sperimentali, hanno identificato l'enhancer distale di Ucp1, hanno analizzato i suoi effetti sulla termogenesi e sulla funzione mitocondriale e hanno pubblicato un documento di ricerca intitolato "Identification of a distal enhancer of Ucp1 essential for thermogenesis and mitochondrial function in brown fat" sulla rivista Communications Biology di Nature. Questo studio fornisce nuovi obiettivi per il trattamento dell'obesità e delle malattie metaboliche correlate.

1. Il contesto della ricerca

Il tessuto adiposo bruno (BAT) regola la temperatura corporea attraverso la termogenesi senza brividi e la proteina disaccoppiante 1 (Ucp1) è una proteina chiave in questo processo. La struttura tridimensionale del genoma è fondamentale per l'espressione genica e gli enhancer possono regolare l'espressione genica. Tuttavia, il meccanismo di regolazione mediato dagli enhancer di Ucp1 rimane poco chiaro.

2. Metodi sperimentali

2.1 Analisi 4C - seq: Condurre esperimenti 4C - seq sul tessuto adiposo bruno interscapolare (iBAT) e sul tessuto adiposo bianco epididimale (eWAT) di topi per analizzare le interazioni cromatiniche di Ucp1 e determinare i siti di interazione affidabili e i siti di interazione differenziali.

2.2 Identificazione degli enhancer: Analizzare i potenziali enhancer di Ucp1 combinando set di dati pubblici. Verificare le loro attività mediante saggi reporter di luciferasi e analizzare le modifiche degli istoni e le interazioni cromatiniche nelle regioni degli enhancer.

2.3 Studi funzionali: Utilizzare il sistema CRISPR - dCas9 - KRAB per inibire gli enhancer e rilevare indicatori quali l'espressione di Ucp1, la funzione mitocondriale e il metabolismo lipidico. Studiare gli effetti regolatori di proteine e fattori correlati sugli enhancer attraverso metodi come l'interferenza dell'RNA e la ChIP - qPCR. In vivo, inibire l'enhancer Ucp1 in iBAT mediante iniezione di lentivirus e osservare gli effetti sulla temperatura corporea del topo, sul metabolismo energetico e sulla funzione mitocondriale.

Attraverso metodi quali l'interferenza con l'RNA (siRNA - knockdown mediato di RAD21) e la 3C - qPCR, studiare l'effetto regolatorio del loop cromatinico mediato dalla coesina sull'interazione tra Ucp1 - En4 e il promotore di Ucp1. L'analisi dei dati Hi-C mostra che i due sono localizzati nella stessa TAD. Dopo l'eliminazione di RAD21, la forza di interazione tra Ucp1 - En4 e il promotore di Ucp1 diminuisce e anche l'espressione di Ucp1 diminuisce significativamente, indicando che la coesina è fondamentale per questa interazione e per la regolazione dell'espressione di Ucp1.

Utilizzare metodi come ChIP - qPCR per studiare gli effetti regolatori di EBF2 e CBP sull'attività dell'enhancer Ucp1 - En4. Le analisi di DNA pull down e ChIP - seq hanno identificato i fattori di trascrizione che si legano a Ucp1 - En4. La ChIP - qPCR ha verificato il legame di EBF2 e CBP e i loro effetti sul livello di H3K27ac. I saggi di reporter luciferasi hanno dimostrato che i due fattori aumentano sinergicamente l'attività trascrizionale di Ucp1 - En4 e che questo meccanismo di regolazione è conservato nei topi e nell'uomo.

Presenta i risultati sperimentali dell'inibizione di Ucp1 - En4 in iBAT in vivo. La microscopia a immunofluorescenza ha confermato il successo dell'infezione da lentivirus. La qRT-PCR e il Western blot sono stati utilizzati per rilevare i cambiamenti di espressione di Ucp1 e dei geni correlati alla lipogenesi. Gli studi metabolici e l'imaging a infrarossi sono stati utilizzati per analizzare indicatori quali il consumo di ossigeno del topo, la termogenesi e la temperatura corporea. È emerso che l'inibizione di Ucp1-En4 influisce sulla termogenesi iBAT, ma non sul consumo energetico dell'intero corpo. La microscopia elettronica a trasmissione e la qPCR sono state utilizzate per rilevare la morfologia e la funzione mitocondriale, indicando che la funzione mitocondriale è compromessa in condizioni di adattamento al freddo.

3. Risultati sperimentali

3.1 Caratteristiche del paesaggio delle interazioni cromatiniche di Ucp1: Esistono differenze nelle interazioni cromatiniche di Ucp1 tra iBAT ed eWAT. Ci sono più siti di interazione in iBAT e alcuni siti sono up-regolati in iBAT. Sono stati identificati quattro enhancer attivi per Ucp1 specifici per iBAT, tre dei quali sono attivati dalla stimolazione con il freddo.

3.2 Verifica funzionale degli enhancer: Ucp1 - En4 e Ucp1 - En6 possono regolare l'espressione di Ucp1 negli adipociti bruni. L'inibizione di questi due enhancer riduce l'espressione di Ucp1, influisce sulla funzione mitocondriale, porta a un aumento delle dimensioni delle gocce lipidiche e a un incremento dell'espressione dei geni correlati alla lipogenesi.

3.3 Meccanismo di regolazione: L'interazione tra Ucp1 - En4 e il promotore di Ucp1 è regolata da un loop cromatinico mediato dalla coesina e la subunità RAD21 è coinvolta. EBF2 e CBP regolano sinergicamente l'attività di Ucp1 - En4 e questo meccanismo è conservato nei topi e nell'uomo.

3.4 Risultati sperimentali in vivo: L'inibizione di Ucp1 - En nell'iBAT in vivo riduce l'espressione di Ucp1, influisce sulla capacità termogenica e sulla funzione mitocondriale dell'iBAT e diminuisce la temperatura corporea dei topi, ma non influisce sul consumo energetico dell'intero corpo.

4. Significato della ricerca

Questo studio rivela il meccanismo di regolazione di Ucp1 nel BAT, identifica i potenziatori chiave, fornisce potenziali bersagli per il trattamento dell'obesità e delle malattie metaboliche e approfondisce la comprensione del meccanismo molecolare della termogenesi nel grasso bruno.

5. Strumenti sperimentali utilizzati nell'esperimento

5.1 Piattaforma di sequenziamento ad alta produttività: Sequenzia la libreria 4C - seq per analizzare le interazioni cromatiniche di Ucp1 in iBAT e eWAT, determinare i siti di interazione e le differenze, ecc.

5.2 Luminometro per micropiastre: Misura l'attività della luciferasi e svolge un ruolo nell'esperimento per valutare l'attività di potenziali potenziatori di Ucp1. L'efficacia dell'enhancer viene giudicata attraverso la rilevazione dell'attività della luciferasi.

5.3 Strumento di PCR quantitativa a fluorescenza in tempo reale: Conduce esperimenti di qRT-PCR per rilevare i livelli di espressione genica, come l'espressione di Ucp1, Rad21 e dei geni correlati alla lipogenesi (Acly, Acaca, Fasn), ecc. per analizzare gli effetti dei fattori correlati sull'espressione genica.

5.4 Software di elaborazione e analisi delle immagini: Osserva i campioni iBAT mediante microscopia elettronica a trasmissione per rilevare la morfologia e la struttura mitocondriale. È emerso che dopo l'inibizione di Ucp1 - En4, in condizioni specifiche, i mitocondri erano gonfi e le cristae irregolari, indicando una funzione mitocondriale compromessa.

5.5 Microscopio elettronico a trasmissione: Esegue l'imaging a fluorescenza degli animali. Dopo aver infettato i topi con il lentivirus, osserva l'infezione e l'espressione del virus in iBAT per confermare l'efficacia dell'operazione sperimentale.

5.6 Sistema di monitoraggio del metabolismo energetico animale (modello Tow-Int Tech: EM - 8M - WA) Misura il metabolismo energetico dell'intero corpo dei topi, compresi indicatori quali il consumo di ossigeno (VO₂) e la termogenesi, per studiare l'impatto di Ucp1 - En4 sul metabolismo energetico complessivo dei topi.

5.7 Termocamera a infrarossi: Ottiene immagini termiche dei topi e le analizza tramite software per rilevare i cambiamenti nella temperatura corporea dei topi. È emerso che dopo l'inibizione di Ucp1 - En4, la temperatura della pelle del dorso e la temperatura rettale dei topi sono diminuite, indicando il suo impatto sulla regolazione della temperatura corporea.

6. Nello studio è stato utilizzato un sistema di metabolismo energetico animale (Tow-Int Tech).

Viene utilizzato per misurare il metabolismo energetico dell'intero corpo dei topi, compresi parametri metabolici come il consumo di ossigeno (VO₂), la produzione di anidride carbonica (VCO₂), il rapporto di scambio respiratorio, l'assunzione di cibo e acqua. Può monitorare i topi per un lungo periodo di tempo nel loro naturale stato di attività.

Metodi sperimentali

Posizionare i topi in gabbie metaboliche in una stanza con temperatura e umidità controllate. La temperatura della stanza è impostata a 4°C o 30°C, l'umidità relativa è del 50% e il ciclo luce/buio è di 12 ore. Prima del monitoraggio, i topi devono essere acclimatati nelle gabbie metaboliche per 24 ore. Dopo l'acclimatazione, utilizzare il sistema di monitoraggio metabolico animale per misurare il consumo di ossigeno e i dati di termogenesi dei topi per valutare lo stato del metabolismo energetico dei topi in diverse condizioni e quindi esplorare l'impatto dei geni correlati o dei potenziatori sul metabolismo energetico dei topi. Ad esempio, quando si studia l'impatto di Ucp1 - En4 sul metabolismo energetico dell'intero corpo dei topi, si osserva se gli indicatori del metabolismo energetico dei topi cambiano dopo aver inibito Ucp1 - En4 attraverso questo sistema.

Riferimento

Su, D., Jiang, T., Song, Y. et al. Identificazione di un enhancer distale di Ucp1 essenziale per la termogenesi e la funzione mitocondriale nel grasso bruno. *Commun Biol* 8, 31 (2025). https://doi.org/10.1038/s42003 - 025 - 07468 - 3

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