Applicazioni del pletismografo a corpo intero nella sepsi

La sepsi può portare all'ARDS e la WBP, come importante strumento di verifica della funzionalità polmonare, è spesso utilizzata negli esperimenti sugli animali.

1. Background Introduzione della sepsi

La sepsi è una grave reazione sistemica scatenata da un'infezione batterica, ma può essere causata anche da infezioni da virus, funghi o altri agenti patogeni. Può portare a disfunzioni d'organo, insufficiente perfusione dei tessuti e anomalie del metabolismo cellulare. Quando la risposta dell'organismo a un'infezione va fuori controllo e inizia a danneggiare i propri tessuti e organi, si verifica la sepsi. La sepsi può progredire rapidamente fino a diventare grave, con disfunzioni acute degli organi e persino svilupparsi in uno shock settico, caratterizzato da un calo significativo della pressione sanguigna e dall'incapacità di mantenere un flusso sanguigno sufficiente agli organi vitali anche con la rianimazione con liquidi. Le fonti comuni di infezione sono le infezioni polmonari (come la polmonite), le infezioni del tratto urinario, le infezioni intra-addominali (come l'appendice perforata), le infezioni cutanee, ecc. Qualsiasi tipo di infezione può potenzialmente scatenare la sepsi in condizioni adeguate.

Il sistema WBP (Whole Body Plethysmography) può essere utilizzato per monitorare la funzione respiratoria di animali da esperimento svegli, che si muovono liberamente, non legati e non anestetizzati, nonché per rilevare l'iperreattività delle vie aeree. Evita gli effetti della tracheotomia e dell'anestesia. Gli animali possono sopravvivere dopo l'esperimento, il che lo rende un metodo sperimentale ideale per studi di follow-up a lungo termine. Può testare più animali contemporaneamente, il che lo rende la scelta migliore per gli esperimenti di screening.

Il sistema WBP può essere utilizzato nella ricerca sulla sepsi ed è anche particolarmente adatto per studi ad alto rendimento come lo screening primario di farmaci, l'analisi farmacologica e di efficacia e l'analisi tossicologica, nonché per studi di follow-up a lungo termine. I parametri respiratori misurati da questo sistema, tra cui la frequenza respiratoria, il volume corrente, il volume minuto di ventilazione, il picco di flusso espiratorio, il picco di flusso inspiratorio, il tempo di espirazione, il tempo di inspirazione e il rapporto tra il tempo di picco di flusso espiratorio (Rpef), hanno un'elevata correlazione con i risultati dei classici test di funzionalità polmonare.

2. Modelli di sepsi nei topi comunemente utilizzati

2.1 Modello di legatura e perforazione cecale (CLP):

È uno dei modelli animali di sepsi più comunemente utilizzati. Induce un'infezione intraperitoneale attraverso la legatura e la perforazione parziale del cieco, simulando così la sepsi causata da un'infezione endogena intra-addominale nell'uomo. Il modello CLP è considerato vicino alla situazione clinica della sepsi perché comporta una complessa miscela di agenti patogeni e lo sviluppo progressivo di disfunzioni d'organo multiple.

2.2 Modello di iniezione di lipopolisaccaridi (LPS):

L'LPS è il componente principale della membrana esterna della parete cellulare dei batteri Gram-negativi. L'iniezione di LPS per via endovenosa o intraperitoneale può indurre una risposta infiammatoria sistemica simile a quella della sepsi umana. Sebbene questo modello sia facile da utilizzare, provoca principalmente una risposta infiammatoria acuta e manca delle caratteristiche multi-stadio tipiche della sepsi.

2.3 Modello di inoculazione batterica:

Iniettare specifici tipi di batteri vivi (come Escherichia coli, Staphylococcus aureus, ecc.) direttamente nel corpo dell'animale per indurre un'infezione locale o sistemica, che poi si sviluppa in sepsi. Questo metodo consente di regolare la gravità della malattia selezionando diversi tipi di batteri e dosi a seconda delle necessità.

2.4 Modello di instillazione intratracheale:

L'instillazione intratracheale di batteri o dei loro prodotti (come l'LPS) viene utilizzata per simulare la sepsi causata da un'infezione polmonare. Questo metodo è particolarmente adatto per studiare la sepsi legata alla polmonite.

3. Il modello di sindrome da distress respiratorio acuto (ARDS) associato alla sepsi nei topi è indotto con il metodo della legatura e perforazione cecale (CLP). Le fasi specifiche sono le seguenti:

Preparazione degli animali sperimentali: Selezionare topi maschi sani C57BL/6 di 6-8 settimane di età e di 22 ± 2 g di peso.

Trattamento anestetico: Anestetizzare i topi con isoflurano.

Operazione chirurgica: Dopo l'effetto dell'anestesia, esporre il cieco del topo. Legare il cieco a circa 1 cm dalla sua estremità. Quindi, bucare il cieco con un ago da 16 in una posizione a 0,5 cm dall'estremità del cieco. Dopo aver completato le operazioni di cui sopra, suturare l'incisione strato per strato.

Rianimazione post-operatoria: Dopo l'operazione, aiutare i topi a riprendersi iniettando sottocute 0,5 ml di soluzione fisiologica normale preriscaldata sul dorso dei topi.

Allestimento del gruppo di controllo: Per i topi del gruppo di controllo, il cieco non viene legato o perforato e le altre procedure chirurgiche sono le stesse del gruppo modello.

Somministrazione del farmaco: Subito dopo la creazione del modello, i topi del gruppo GL + CLP vengono iniettati per via intraperitoneale con acido glicirrizico (GL, 15mg/kg). GL è disciolto in 200 μl di solvente (2% DMSO + 40% peg300 + 5% Tween80 + 53% ddh2O).

Rilevamento della funzione polmonare: Eseguire il rilevamento della funzione polmonare sui topi del gruppo modello e del gruppo bianco 16-20 ore dopo l'intervento.

Raccolta dei campioni: Prelevare i campioni richiesti 24 ore dopo l'intervento.

4. Metodi di valutazione della sepsi

4.1 Osservare il tasso di sopravvivenza a 7 giorni:

Valutare osservando e registrando lo stato di sopravvivenza dei topi entro 7 giorni. Il tasso di sopravvivenza dei topi del gruppo CLP è basso. l'80% di loro sopravvive a 24 ore, solo il 10% sopravvive a 7 giorni e non ci sono più decessi dopo 72 ore. Mentre il tasso di sopravvivenza a 24 ore del gruppo GL+CLP è dell'85%, il tasso di sopravvivenza a 7 giorni è del 40% e non ci sono decessi dopo 42 ore. Il tasso di sopravvivenza è significativamente inferiore al livello normale, il che è in linea con le caratteristiche della sepsi grave e dell'alto tasso di mortalità, e riflette indirettamente il successo dell'istituzione del modello.

4.2 Esame patologico del tessuto polmonare:

Eseguire la colorazione ematossilina-eosina (HE) sul tessuto polmonare del topo, osservare i cambiamenti patologici del tessuto polmonare e calcolare il punteggio della lesione polmonare. Rispetto al gruppo di controllo, il tessuto polmonare dei topi del gruppo CLP è gravemente danneggiato. La struttura alveolare è distrutta, l'interstizio polmonare è significativamente ispessito, accompagnato da emorragie e da un gran numero di infiltrazioni di cellule infiammatorie, e il punteggio del danno polmonare è significativamente aumentato. Queste caratteristiche patologiche sono coerenti con l'ARDS indotta dalla sepsi, indicando il successo della creazione del modello.

4.3 Rilevamento del rapporto umido/secco (W/D) del tessuto polmonare e della concentrazione di proteine nel liquido di lavaggio broncoalveolare (BALF):

Il rapporto W/D del polmone e la concentrazione di proteine nel BALF dei topi del gruppo CLP aumentano significativamente. Si tratta di due indicatori importanti che riflettono il danno della barriera alveolo-capillare e l'aumento della permeabilità del tessuto polmonare durante l'ARDS. I cambiamenti di questi indicatori indicano che i topi modello presentano cambiamenti patologici simili all'ARDS, a sostegno del successo dell'istituzione del modello di sepsi.

4.4 Rilevamento della formazione di trappole extracellulari dei neutrofili (NET) nel tessuto polmonare:

Rilevare il contenuto di Cit-H3 (un marcatore dei NET) nel tessuto polmonare mediante colorazione in immunofluorescenza. Il contenuto di Cit-H3 nel tessuto polmonare dei topi del gruppo CLP è superiore a quello del gruppo di controllo, il che significa che la formazione di NET aumenta. Poiché i NET sono correlati alla progressione della sepsi, l'aumento della loro quantità indica che nei topi si è verificata una risposta immunitaria correlata alla sepsi, il che costituisce una delle prove del successo dell'istituzione del modello.

4.5 Rilevamento dell'espressione di proteine e geni nelle vie di segnalazione correlate:

Utilizzare western blot e PCR quantitativa in tempo reale per rilevare i livelli di espressione proteica e genica di HMGB1, TLR9, MyD88 e IL6 nel tessuto polmonare. L'espressione di queste molecole nel gruppo CLP aumenta in modo significativo. Esse sono coinvolte nella regolazione della risposta infiammatoria e nella formazione dei NET nella sepsi e i cambiamenti nella loro espressione sono coerenti con il meccanismo patologico della sepsi, confermando ulteriormente il successo dell'istituzione del modello.

4.6 Valutazione della funzione polmonare

La funzione polmonare dei topi può essere rilevata utilizzando il sistema di pletismografia Whole Body sviluppato dalla TaWang Technology. Molti indicatori della funzione polmonare dei topi nel gruppo CLP cambiano significativamente rispetto a quelli del gruppo di controllo. Ad esempio, F, Vt e MV, che riflettono la ventilazione alveolare, diminuiscono, indicando una riduzione della ventilazione alveolare; PIF, PEF e Rpef, che riflettono la forza dei muscoli respiratori e l'ostruzione delle piccole vie aeree, diminuiscono, indicando la presenza di affaticamento respiratorio e limitazione del flusso d'aria; Ti e Te sono prolungati, indicando la presenza di ostruzione respiratoria o edema polmonare; EF50 aumenta e Tr è prolungato, indicando un aumento della resistenza delle vie aeree. Questi cambiamenti nella funzione polmonare sono coerenti con le caratteristiche dell'ARDS indotta dalla sepsi, indicando il successo della creazione del modello.

5. Tow-Int Tech - Sistema di pletismografia corporea, WBP

Il sistema di pletismografia Whole Body (WBP) sviluppato da Tow-Int Tech è in grado di misurare i parametri respiratori di animali svegli e in movimento, come la frequenza respiratoria, il volume corrente e il test di iperreattività delle vie aeree (AHR). Durante il test, gli animali possono essere in uno stato di veglia e libertà, evitando gli effetti della tracheotomia traumatica e dell'anestesia, rendendo il processo sperimentale più conveniente. Viene utilizzato per lo studio della reattività degli animali in modelli di sistema respiratorio a farmaci e altre sostanze, nonché per gli studi farmacologici e tossicologici di farmaci respiratori. È particolarmente adatto per test di screening primario rapido su un gran numero di animali, studi di follow-up a lungo termine e screening ripetitivi.

Specie animali applicabili: Topi, giovani topi, ratti, cavie, conigli, cani, gatti, maiali in miniatura, scimmie e altri animali.

È dotato di un dispositivo di alimentazione e abbeveraggio per facilitare gli esperimenti a lunghissimo termine.

Canali di misura: 1-64 canali.

Funzione di controllo automatico del flusso di bias.

Può essere configurato con un sistema di nebulizzazione oscillante ad alta frequenza.

Dispone di una speciale struttura di riduzione del rumore, in grado di ridurre efficacemente le interferenze causate dai cambiamenti ambientali.

Può eseguire la riduzione del rumore del flussometro di polarizzazione per migliorare il rapporto segnale/rumore del segnale e ridurre il rumore del sistema.

Supporta il collegamento esterno di azoto o altri gas per completare gli esperimenti di ipossia.

È dotato di un software di analisi e i dati possono essere salvati in formato excel o txt.

Il software può commutare automaticamente fino a quattro canali di gas diversi e può essere gestito tramite un controller esterno.

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