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Una scoperta innovativa: Modello murino per la valutazione rapida dell'attività dei farmaci anti-Mycobacterium tuberculosis tramite somministrazione per inalazione

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Un nuovo modello murino non invasivo che utilizza M. tuberculosis autoluminescente consente di valutare rapidamente l'efficacia dei farmaci anti-TB per via inalatoria attraverso la misurazione della RLU.

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A causa delle caratteristiche farmacocinetiche non ottimali delle vie orali o iniettabili convenzionali, l'efficacia della maggior parte dei composti contro il Mycobacterium tuberculosis (MTB) è spesso limitata da un'inefficiente distribuzione e metabolismo del farmaco. Per aumentare le concentrazioni di farmaco localizzate nei polmoni, la somministrazione per via inalatoria è emersa come una priorità di ricerca, consentendo una somministrazione mirata per aumentare direttamente l'esposizione al farmaco nei siti di infezione. Tuttavia, i modelli esistenti si basano prevalentemente su ceppi di MTB wild-type, che soffrono di complessità operativa, tempi sperimentali prolungati, alti costi di manodopera e scarsa riproducibilità.

In questo studio, Tian X, Gao Y, Ma W e colleghi hanno sviluppato un modello di valutazione basato sull'inalazione utilizzando il Mycobacterium tuberculosis autoluminescente (AIRv). Questo modello monitora dinamicamente l'attività del farmaco quantificando le unità di luce relativa (RLU) emesse da topi vivi infettati con il ceppo autoluminescente. L'approccio innovativo offre i seguenti vantaggi:

1. Procedure semplificate: Elimina la necessità di anestesia dei topi, semplificando la somministrazione dei farmaci e il funzionamento degli strumenti.

2. Efficienza dei costi: Sostituisce i modelli animali di grandi dimensioni con i topi, riducendo significativamente i costi sperimentali.

3. Tempi accelerati: Comprime il periodo di valutazione tradizionale da mesi a 16-17 giorni.

4. Valutazione non invasiva: Utilizza RLU vivi come surrogato delle unità formanti colonie (CFU), evitando il sacrificio di animali.

5. Capacità di produzione elevata: Consente la somministrazione giornaliera simultanea a sei topi, con un potenziale di 2-3 dosi al giorno.

6. Maggiore affidabilità: Le misurazioni RLU oggettive riducono al minimo l'intervento umano e migliorano la riproducibilità.

Gli esperimenti di prova di concetto hanno dimostrato che la rifampicina, l'isoniazide e l'etambutolo inalati hanno mostrato una potente attività antitubercolare a basse concentrazioni (0,5, 0,5 e 0,625 mg/mL, rispettivamente), con risultati RLU fortemente correlati all'efficacia terapeutica. Un'ulteriore convalida ha confermato un rapporto coerente (~10:1) tra RLU polmonari e CFU, rafforzando il ruolo delle RLU come indicatore affidabile di efficacia. Questo metodo costituisce una piattaforma efficiente e precisa per la valutazione rapida dell'attività dei farmaci inalati in vivo.

Metodi sperimentali

1. Ceppo e coltura:

Il ceppo di Mycobacterium tuberculosis autoluminescente (AIRv), portatore del cluster genico luxCDABE, è stato coltivato in brodo Middlebrook 7H9 fino al raggiungimento della fase di crescita logaritmica (OD600 = 0,6-0,8; RLUs ≈ 5 × 10⁹/mL).

2. Costituzione del modello animale

2.1 Infezione: Femmine di topi BALB/c sono state infettate con AIRv tramite un sistema di inalazione di aerosol e suddivise in modo casuale in gruppi (6 topi per gruppo).

2.2 Carica batterica iniziale: Il giorno 3 (Esperimento 1) o il giorno 1 (Esperimento 2) dopo l'infezione, i topi sono stati anestetizzati per la rilevazione della RLU del torace. Un sottogruppo di topi è stato eutanizzato e gli omogenati polmonari sono stati analizzati per RLU e CFU (tramite piastre di agar 7H10 con un'incubazione di 4 settimane) per valutare i livelli di infezione di base.

3. Somministrazione del farmaco per inalazione

I farmaci (rifampicina [RIF], isoniazide [INH] ed etambutolo [EMB]) disciolti in acqua sterilizzata (intervallo di dosi: 0,125-10 mg/mL) sono stati nebulizzati e somministrati quotidianamente utilizzando un dispositivo di esposizione solo nasale (Tow Systems Nose-Only). Ogni sessione di trattamento è durata 20-25 minuti, continuando per 14-15 giorni.

4. Valutazione dell'efficacia

4.1 RLU da vivo: Le RLU sono state misurate in modo non invasivo dalla regione toracica di topi vivi utilizzando un luminometro (GLOMAX 20/20) per il monitoraggio dinamico dell'efficacia del farmaco.

4.2 Analisi finale: Dopo l'esperimento, i topi sono stati sottoposti a eutanasia. Le RLU e le CFU dell'omogenato polmonare sono state quantificate per convalidarne la correlazione (rapporto approssimativo: 10:1).

5. Studi farmacocinetici

5.1 Campionamento: Il plasma e i tessuti polmonari sono stati raccolti in punti specifici dopo l'inalazione. Le concentrazioni di farmaco sono state determinate mediante cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC-MS).

5.2 Calcolo dei parametri: I parametri farmacocinetici, tra cui l'area sotto la curva (AUC) e l'emivita (t₁/₂), sono stati analizzati per valutare la ritenzione e l'efficacia del farmaco nei tessuti polmonari.

Risultati sperimentali

1. Convalida dell'efficacia del modello murino

Forte correlazione tra RLU e CFU: Le unità di luce relativa (RLU) di Mycobacterium tuberculosis (AIRv) autoluminescente nei polmoni hanno mostrato un rapporto costante di circa 10:1 con le unità formanti colonie (CFU) (p<0,0001), confermando che le RLU sono un marcatore surrogato affidabile per la valutazione rapida dell'efficacia del farmaco.

2. Valutazione dell'attività del farmaco

2.1 Esperimento a dose singola: Rifampicina (RIF 2 mg/mL), isoniazide (INH 2 mg/mL) ed etambutolo (EMB 10 mg/mL) hanno ridotto significativamente sia le RLU polmonari che le CFU rispetto al controllo con solvente (p<0,0001). L'INH ad alta dose (2 mg/mL) ha quasi eradicato i batteri, con CFU prossime allo zero.

2.2 Attività dose-dipendente: Rifampicina: Solo la dose più alta (2 mg/mL) ha mostrato un'inibizione batterica significativa (p<0,0001), mentre le dosi inferiori (0,5 e 0,125 mg/mL) sono risultate inefficaci. Isoniazide: Sia 2 mg/mL che 0,5 mg/mL hanno ridotto significativamente la carica batterica (p<0,0001), mentre 0,125 mg/mL non ha avuto alcun effetto.Etambutolo: Le dosi di 10 mg/mL e 2,5 mg/mL hanno ridotto marcatamente le RLU e le CFU (p<0,0001), mentre la dose più bassa (0,625 mg/mL) ha mostrato un'efficacia più debole (p<0,05).

3. Proprietà farmacocinetiche

3.1 Assorbimento rapido: Rifampicina (2 mg/mL): La concentrazione plasmatica di picco (16,65 ± 3,91 μg/mL) e la concentrazione nel tessuto polmonare (2,33 ± 0,89 μg/g) sono state raggiunte entro 5 minuti dall'inalazione. Isoniazide (0,5 mg/mL): Le concentrazioni polmonari sono scese a livelli quasi irrilevanti entro 30 minuti, rendendo necessarie più dosi giornaliere. Etambutolo (10 mg/mL): La concentrazione polmonare di picco ha raggiunto 10,94 ± 1,63 μg/g, mantenendo livelli efficaci (>10 ore).

3.2 Ritenzione prolungata: la rifampicina e l'etambutolo hanno mantenuto concentrazioni efficaci nel tessuto polmonare per 24 ore e 10 ore, rispettivamente, superando significativamente le loro concentrazioni minime inibitorie (MIC) in vitro.

Conclusione

Integrando ceppi batterici autoluminescenti con la tecnologia di somministrazione per inalazione, questo modello consente una valutazione rapida e precisa dell'attività dei farmaci antitubercolari. Migliora significativamente l'efficienza dello sviluppo dei farmaci e fornisce un supporto tecnico fondamentale per lo sviluppo di nuovi regimi terapeutici.

Sistema di esposizione per inalazione solo nasale Tow-Int Tech

In questo studio, il sistema di esposizione per inalazione solo nasale di Tow-Int Tech è stato utilizzato per somministrare terapie per via inalatoria (ad esempio, rifampicina) ai topi. I risultati hanno dimostrato che questo approccio basato sull'inalazione ha migliorato significativamente l'efficacia terapeutica rispetto alle tradizionali vie orali o iniettabili, migliorando l'efficienza dello sviluppo dei farmaci.

Il sistema di esposizione per inalazione naso/bocca è stato progettato per una precisa somministrazione di farmaci per via orale/nasale e per esperimenti di esposizione per inalazione in animali da laboratorio come topi, ratti e cavie. Caratterizzato da un design ermetico e da una concentrazione uniforme dell'esposizione, il sistema è ideale per gli studi di inalazione con aerosol liquidi, aerosol di polvere, aerosol di nanoparticelle, fumo e altri agenti inalabili. Assicura un dosaggio coerente tra gli animali dello stesso gruppo sperimentale, consente il monitoraggio in tempo reale della concentrazione di aerosol e la raccolta di campioni e incorpora un sistema di controllo ad alta precisione per mantenere l'omogeneità e la stabilità dell'esposizione.

Inoltre, il sistema supporta la sperimentazione di diverse sostanze, tra cui farmaci, inquinanti atmosferici (ad esempio, PM2,5), composti organici, sostanze chimiche industriali e agenti agricoli. Il sistema è in grado di gestire diversi protocolli sperimentali, come l'esposizione acuta/cronica, le condizioni di bassa/alta pressione e gli ambienti ipossici/iperossici, offrendo flessibilità per la ricerca tossicologica e farmacologica avanzata.

Riferimenti:

[1]Tian X, Gao Y, Ma W, et al. Establishment of an Inhalation Administration Non-invasive Murine Model for Rapidly Testing Drug Activity against Mycobacterium tuberculosis[J]. bioRxiv, 2024: 2024.02. 27.582260.

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