Optogenetica e pletismografia del corpo intero

esplorare i meccanismi di controllo del ritmo respiratorio

Introduzione

Lo studio intitolato "Dbx1 Pre-Bötzinger Complex Interneurons Comprise the Core Inspiratory Oscillator for Breathing in Unanesthetized Adult Mice" di Nikolas C. Vann et al., pubblicato su eNeuro, indaga il meccanismo con cui i neuroni pre-Bötzinger Complex (preBötC) derivati da Dbx1 generano ritmi respiratori in topi adulti coscienti. Utilizzando tecniche di optogenetica, i ricercatori hanno manipolato con precisione l'attività dei neuroni Dbx1 preBötC che esprimono l'arcaerodopsina (una proteina inibitoria sensibile alla luce) o la canalrodopsina (una proteina eccitatoria sensibile alla luce) e hanno valutato l'impatto sul comportamento respiratorio.

Background della ricerca

I movimenti respiratori nei mammiferi hanno origine dall'attività neurale ritmica del complesso pre-Bötzinger (preBötC) del tronco encefalico. Tuttavia, la precisa composizione neuronale del preBötC rimane poco chiara. Si ritiene che i neuroni derivati da Dbx1 svolgano un ruolo significativo nella generazione dei ritmi respiratori. Questi neuroni mostrano scariche ritmiche nei topi perinatali, ma il loro ruolo nei topi adulti non è stato definitivamente stabilito a causa del loro coinvolgimento nel controllo dei modelli motori e nelle funzioni non respiratorie.

Metodi sperimentali

Animali sperimentali

Le femmine di topi Dbx1CreERT2, che esprimono la Cre ricombinasi sensibile al tamoxifene in cellule progenitrici derivate da Dbx1, sono state incrociate con topi portatori di vari geni reporter. L'espressione neuronale è stata indotta mediante trattamento con tamoxifene, mentre i cuccioli wild-type sono stati utilizzati come controllo. Tutti gli esperimenti sono stati approvati dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali e si sono attenuti alle politiche e alle linee guida pertinenti.

Preparazione delle fette cerebrali e registrazioni

I topi neonatali Dbx1;ArchT sono stati anestetizzati con ipotermia e decapitati. Le fette di cervello contenenti la preBötC sono state preparate e perfuse in una camera di registrazione con un'elevata concentrazione di ioni potassio. Sono state registrate le uscite motorie inspiratorie e sono state utilizzate registrazioni patch-clamp a cellule intere per rilevare i cambiamenti nei potenziali di membrana neuronali.

Iniezione virale e impianto di fibra ottica

I topi adulti Dbx1;ArchT e Dbx1;CatCh sono stati anestetizzati e sottoposti a craniotomia per le iniezioni virali e l'impianto di fibre ottiche. I topi Dbx1;CatCh hanno ricevuto iniezioni di virus per indurre la ricombinazione prima dell'impianto della fibra. Dopo il recupero, sono stati condotti gli esperimenti.

Misure respiratorie

Il comportamento respiratorio è stato misurato con la pletismografia del corpo intero. I topi sono stati leggermente sedati con ketotifen o brevemente anestetizzati con isoflurano al 2%. La respirazione è stata valutata misurando i segnali del flusso d'aria attraverso un circuito di pressione e un trasduttore di pressione differenziale.

Manipolazione optogenetica

I topi sono stati esposti a impulsi di luce di diversa intensità (6,8, 8,6 o 10,2 mW) e durata (5 secondi o 100 millisecondi) erogati a intervalli di almeno 30 secondi. Sono state eseguite più stimolazioni su ciascun topo e sono state analizzate le variazioni della frequenza respiratoria, del volume tidalico, della ventilazione minima e degli effetti di ripristino della fase.

Analisi dei dati

I parametri respiratori sono stati analizzati utilizzando il software di pletismografia. Per confrontare i parametri nelle diverse condizioni sono stati utilizzati test t a coppie e altri metodi statistici. Le curve di risposta di fase sono state tracciate raggruppando e mediando gli effetti di fase respiratoria degli impulsi luminosi.

Esame istologico

Dopo l'esperimento, gli animali sono stati sottoposti a perfusione e fissazione dei tessuti. Le sezioni cerebrali sono state colorate con NeuroTrace ed esaminate in microscopia a campo chiaro e confocale per verificare il posizionamento delle punte delle fibre e regolare il contrasto delle immagini.

Risultati della ricerca

Attivazione optogenetica (topi Dbx1;CatCh)

La stimolazione luminosa della preBötC ha aumentato la frequenza respiratoria sia in stato di anestesia che di veglia, ma non ha influenzato significativamente il volume corrente o la ventilazione minima. I cuccioli wild-type non hanno mostrato cambiamenti. La stimolazione luminosa di breve durata durante la fase inspiratoria prolungava il tempo inspiratorio e ritardava i respiri successivi (ritardo di fase). Durante la transizione inspiratoria-espiratoria o le fasi espiratorie, la stimolazione ha anticipato i respiri successivi (anticipo di fase).

Inibizione optogenetica (topi Dbx1;ArchT)

L'inibizione luminosa della preBötC ha ridotto la frequenza respiratoria, il volume corrente e la ventilazione minima sia in stato di anestesia sia in stato di veglia, con un'intensità luminosa maggiore che ha portato a effetti maggiori, compreso l'arresto respiratorio. I cuccioli wild-type non hanno mostrato cambiamenti. L'inibizione della luce di breve durata durante l'inspirazione precoce ha anticipato l'inspirazione successiva (anticipo di fase) e ha ridotto il tempo di inspirazione. Nell'espirazione precoce, ritarda l'inspirazione successiva (ritardo di fase).

Risultati elettrofisiologici

In fette di cervello neonatale di topo Dbx1;ArchT, la luce a 589 nm ha causato l'iperpolarizzazione dei neuroni Dbx1 preBötC, sopprimendo la generazione del ritmo e le uscite motorie. Gli effetti dell'iperpolarizzazione erano prevalentemente postsinaptici diretti e interessavano in minima parte i neuroni non-Dbx1.

Discussione

Generazione di ritmi e schemi

L'inibizione prolungata della luce ha ridotto la frequenza respiratoria e ha persino causato un arresto respiratorio, indicando che i neuroni Dbx1 sono parte integrante dell'oscillatore centrale. La riduzione del volume tidalico suggerisce il loro ruolo nel controllo del pattern motorio. La stimolazione luminosa prolungata ha aumentato significativamente la frequenza, con differenze rispetto ad altri studi dovute a variazioni delle condizioni sperimentali.

Esperimenti di ripristino della fase

Sia l'attivazione che l'inibizione di breve durata hanno influenzato la fase respiratoria e il tempo di inspirazione attraverso i cicli, supportando l'idea che i neuroni Dbx1 preBötC siano parte del generatore del ritmo inspiratorio.

Esclusione di effetti non specifici

Il disegno sperimentale ha escluso il contributo di perturbazioni dell'ingresso preBötC, dei terminali assonali o degli assoni di passaggio, corroborando ulteriormente il ruolo dei neuroni Dbx1 preBötC nella generazione del ritmo.

Ruolo delle cellule gliali

È improbabile che le cellule gliali influenzino i risultati degli esperimenti di inibizione. Mentre l'espressione di CatCh nelle cellule gliali potrebbe aver contribuito agli esperimenti di attivazione, il confronto degli effetti di ArchT e CatCh ha suggerito un ruolo dominante dei neuroni.

Dimensione dell'oscillatore centrale

Sebbene la maggior parte dei neuroni Dbx1 preBötC svolga funzioni non ritmiche, un sottoinsieme forma il core oscillator inspiratorio. Sono necessari studi futuri per quantificare la percentuale di neuroni ritmogenici non derivati da Dbx1 e distinguere tra neuroni Dbx1 ritmogenici e non ritmogenici.

Conclusioni

Questo studio rivela che i neuroni Dbx1 preBötC influenzano direttamente la frequenza e la tempistica respiratoria, stabilendo che sono una componente centrale dell'oscillatore inspiratorio. Questi risultati migliorano la nostra comprensione della fisiologia respiratoria, con implicazioni per lo studio dei disturbi respiratori e lo sviluppo di bersagli terapeutici.

Apparecchiature utilizzate nello studio

Sistema pletismografico per il corpo intero

Utilizzato per misurare il comportamento respiratorio in animali che si muovono liberamente. Il sistema rileva le variazioni di volume causate dal movimento toracico, convertendo i segnali di pressione in segnali elettrici per l'analisi delle curve respiratorie e il calcolo dei parametri (ad esempio, volume corrente, picco di flusso espiratorio, frequenza respiratoria).

Apparecchiatura optogenetica

Il laser a 589-nm (Dragon Lasers) e il laser a 473-nm (Dragon Lasers) sono stati utilizzati per collegare le fibre ottiche dei topi Dbx1;ArchT e Dbx1;CatCh, rispettivamente, per consentire le operazioni optogenetiche.

Sistema di pletismografia su tutto il corpo Tow-Int Tech

Progettato per testare la funzione respiratoria e la reattività delle vie aeree in animali coscienti e non legati. Combinando l'optogenetica con misurazioni respiratorie avanzate, il sistema facilita la ricerca sui meccanismi di controllo del ritmo respiratorio, offrendo dati precisi e affidabili per lo studio di condizioni fisiologiche e patologiche.

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