Quali sono le tecniche di biopsia liquida?

Quali sono le tecniche di biopsia liquida?

Che cos'è una biopsia liquida?

Nell'elenco delle 10 Breakthrough Technologies 2015 pubblicato dalla rivista MIT Technology Review, la tecnologia della biopsia liquida è stata inserita nell'elenco.

confronto tra biopsia tradizionale e biopsia liquida

La biopsia liquida si riferisce all'analisi e alla diagnosi del cancro e di altre malattie attraverso l'analisi del sangue o di altri fluidi corporei come urina, saliva, versamento pleurico, liquido cerebrospinale, ecc. Il fluido corporeo del paziente viene utilizzato principalmente come campione per la biopsia tumorale e gli oggetti catturati e rilevati includono cellule tumorali circolanti (CTC), DNA tumorale circolante (ctDNA) ed esosomi nei fluidi corporei. La biopsia liquida è uno dei settori più caldi dell'industria biomedica negli ultimi anni. Rispetto alla biopsia tissutale standard, la biopsia liquida presenta alcuni vantaggi teorici: meno traumi, riproducibilità, giudizio di efficacia in tempo reale, adeguamento dinamico delle decisioni terapeutiche, ecc.

tipo di campione della biopsia liquida

La comparsa della tecnologia della biopsia liquida segna un altro grande passo avanti per l'umanità sulla strada della conquista del cancro. Rispetto alla tradizionale biopsia tissutale, la biopsia liquida presenta diversi vantaggi: In primo luogo, la biopsia liquida può sostituire le aree che la biopsia tissutale non può raggiungere. In secondo luogo, le biopsie tissutali possono riflettere solo le informazioni contenute nel campione, mentre le biopsie liquide possono rilevare le condizioni generali del paziente. Inoltre, le biopsie liquide rilevano principalmente il DNA tumorale circolante (ctDNA), che di solito viaggia dal tessuto tumorale ai vasi sanguigni. Di conseguenza, le biopsie liquide localizzano le cellule tumorali più rapidamente rispetto alla diagnosi basata su sintomi e immagini. La tecnologia della biopsia liquida è economicamente vantaggiosa. Grazie al campionamento non invasivo, può non solo ridurre notevolmente le difficoltà di diagnosi e cura del cancro, ma anche anticipare i tempi di diagnosi del cancro e prolungare efficacemente il periodo di sopravvivenza dei pazienti.

#01

Cellule tumorali circolanti (CTC) e tumori

1）Le cellule tumorali circolanti (CTC) sono definite come quelle cellule tumorali che lasciano le lesioni tumorali solide ed entrano nel flusso sanguigno. Le CTC non sono gli unici derivati del tumore in circolo, ma contengono una serie di precursori metastatici essenziali per la progressione completa della malattia. Le cellule tumorali circolanti che entrano in circolo contengono il genoma completo, il proteoma e altre informazioni biologiche e hanno il potenziale per svilupparsi in lesioni metastatiche, rappresentando l'aggressività dei tumori.

▲Introduzione ai componenti del sangue

Tuttavia, le condizioni tecniche limitano l'isolamento delle CTC vive, soprattutto a causa della difficoltà di isolare le CTC in quanto rare rispetto alle cellule del sangue. Tuttavia, non mancano tecnologie di recente sviluppo in grado di catturare e isolare le CTC e di analizzarle a livello molecolare per verificarne l'idoneità alle applicazioni cliniche. Dal punto di vista clinico, le CTC hanno dimostrato il loro valore come biomarcatori predittivi della prognosi delle malattie e la loro idoneità per altre applicazioni è in fase di sperimentazione. Tecnicamente, è generalmente necessario arricchire le cellule tumorali circolanti dalle cellule ematiche massive e distinguere le cellule tumorali maligne dai globuli bianchi e dai globuli rossi.

2) In passato sono state sviluppate numerose tecniche specializzate per l'isolamento delle CTC che, in sostanza, possono essere suddivise in due grandi categorie: ① cellule che catturano le CTC in base all'espressione di antigeni specifici (selezione positiva); ② consumano tutte le cellule non CTC (selezione negativa).

Una delle tecniche classiche di selezione positiva delle CTC si basa su una procedura in due fasi: la prima fase prevede la centrifugazione del campione per eliminare i componenti plasmatici, mentre le CTC vengono catturate utilizzando un ferrofluido magnetico coniugato con la molecola di adesione delle cellule epiteliali (EpCAM); nella seconda fase, le CTC putative sono state ulteriormente colorate e identificate utilizzando un anticorpo anti-citocheratina, mentre i globuli bianchi contaminanti (WBC) sono stati identificati mediante colorazione CD45. I progressi della tecnologia di sequenziamento di singole cellule stanno anche facilitando l'analisi molecolare di campioni cellulari di rare CTC singole.

3) CTC singole e cluster di CTC. Un cluster di CTC è definito come un gruppo di due o più CTC con giunzioni cellula-cellula stabili che passano insieme nel sangue. Rispetto alle singole CTC, i cluster di CTC presentano profili di espressione genica e modelli di diffusione distinti. L'analisi del trascrittoma ha mostrato che gli ammassi di CTC mantengono caratteristiche epiteliali. Le giunzioni cellula-cellula possono svolgere un ruolo chiave nella formazione e nel mantenimento del sistema circolatorio. Attualmente sono in pieno svolgimento anche le ricerche correlate sui cluster di CTC.

▲ CTC e ammassi di CTC

#02

DNA tumorale circolante (ctDNA) e tumore

1）Il ctDNA è di solito un frammento di DNA secreto attivamente dalle cellule tumorali o rilasciato in circolo durante l'apoptosi o la necrosi delle cellule tumorali, con una lunghezza di 132-145 bp e un'emivita breve (generalmente <2 h). Il ctDNA trasporta caratteristiche genetiche derivate dalle cellule tumorali, come la mutazione, la metilazione, l'amplificazione o il riarrangiamento dei geni, e può essere utilizzato come importante indicatore per lo screening dei tumori, la diagnosi complementare, la valutazione dell'efficacia del trattamento e la stratificazione del rischio prognostico. La biopsia liquida è un metodo minimamente invasivo per visualizzare la somma di ctDNA in siti tumorali primari e secondari. Non solo è possibile quantificare la quantità di ctDNA, ma è anche possibile identificare i cambiamenti genetici. Mutazioni specifiche nei geni sono state identificate nel plasma di diversi tipi di pazienti affetti da cancro, evidenziando il ctDNA come possibile biomarcatore del cancro. Tuttavia, ottenere concentrazioni rilevabili di ctDNA nei fluidi corporei non è banale e i frammenti di ctDNA hanno un'emivita breve。

▲Consenso degli esperti sulla pratica clinica del sequenziamento ad alta velocità del ctDNA nel 2022

Il consenso degli esperti sulla pratica clinica del sequenziamento ad alta velocità del ctDNA nel 2022 ha sottolineato: Con il rapido sviluppo della biopsia liquida, è possibile utilizzare i fluidi corporei per analizzare le caratteristiche molecolari dei pazienti, in particolare il sequenziamento ad alto rendimento del DNA tumorale circolante (ctDNA). La tecnologia di sequenziamento di nuova generazione (NGS) è stata sempre più utilizzata in clinica grazie ai suoi vantaggi di non invasività o minimamente invasiva, breve tempo di rilevamento, capacità di riflettere l'eterogeneità intratumorale e metastatica e monitoraggio dinamico dell'efficacia terapeutica.

i livelli di DNA sono generalmente dinamici e influenzati da molteplici fattori

i livelli di ctDNA sono generalmente dinamici e influenzati da una serie di fattori:

i livelli di ctDNA sono generalmente più bassi nei pazienti con tumori con un carico tumorale minore, con sedi specifiche (ad esempio, tumori intracranici) e istologie specifiche (ad esempio, gliomi) e con livelli più bassi di proliferazione, apoptosi e vascolarizzazione.

b. interferenza del DNA da numerose altre fonti. Come altre cellule normali o il DNA derivato dai leucociti, insieme al ctDNA è chiamato DNA libero da cellule (cfDNA).

c Le informazioni sulle mutazioni geniche trasportate dal cfDNA prodotto dalle cellule ematopoietiche clonali possono interferire con i risultati del dosaggio del ctDNA.

d. Il ctDNA ha un'emivita breve e gli effetti dei farmaci possono influenzare il contenuto di ctDNA.

Rispetto all'esame istologico, il test del ctDNA presenta i vantaggi della non invasività o della minima invasività, del campionamento ripetuto e dei tempi brevi per la raccolta, l'elaborazione e i rapporti di analisi. Il ctDNA plasmatico ha anche aumentato il tasso di rilevamento delle mutazioni del gene driver rispetto alla sola biopsia tissutale. Tuttavia, rispetto ai campioni di tessuto, il contenuto di ctDNA nel sangue periferico è inferiore, il che è soggetto a risultati falsi negativi nei test clinici. Il mancato utilizzo dei leucociti come controllo può anche portare a risultati falsi positivi dovuti a variazioni germinali o mutazioni ematopoietiche clonali. Inoltre, esistono anche differenze nella quantità di ctDNA rilasciata nel sangue tra diversi pazienti affetti da tumore o tra lo stesso paziente in momenti diversi, il che comporta difficoltà nella rilevazione e nell'interpretazione clinica del ctDNA.

2 Applicazione del ctDNA nella diagnostica complementare. La diagnostica di accompagnamento (CDx) è considerata uno strumento indispensabile nella medicina personalizzata dei tumori, che richiede che le informazioni fornite dai risultati dei test siano sufficienti a garantire la sicurezza e l'efficacia dei farmaci terapeutici corrispondenti. Pazienti che beneficiano di un trattamento specifico. La prima applicazione clinica della rilevazione del ctDNA come CDx è stata la rilevazione delle mutazioni del recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR), utilizzata principalmente per identificare i pazienti con NSCLC avanzato che possono beneficiare dei TKI EGFR.

Nello studio ENSURE, il ctDNA ha rilevato le mutazioni EGFR 19del e L858R con una specificità del 98,2% e una sensibilità del 76,7%; i pazienti trattati con erlotinib sulla base dei risultati del ctDNA hanno avuto una PFS significativamente migliore rispetto ai pazienti sottoposti a chemioterapia. Sulla base dei risultati di questo studio, la FDA ha approvato il primo prodotto CDx per biopsia liquida, Cobas EGFR Mutation Test v2, nel 2016, seguito dalla National Medical Products Administration (NMPA) nel 2019 per approvare il lancio nazionale di questo prodotto CDx. Nello studio FLAURA, il tasso di risposta obiettiva (ORR) dei pazienti positivi al ctDNA T790M a osimertinib è risultato coerente con quello dei pazienti con biopsia tumorale positiva. Ciò ha aperto un'ondata di hotspot di ricerca nel rilevamento del ctDNA nella malattia minima residua (MRD) e nel deficit di ricombinazione omologa (HRD).

3 Punti chiave della tecnologia di rilevamento del ctDNA NGS. La fase intermedia dell'analisi comprende due fasi: "esperimento a umido" e "esperimento a secco". l'"esperimento a umido" comprende l'estrazione dell'acido nucleico, la progettazione e la sintesi di primer o sonde, la preparazione della libreria, il sequenziamento a bordo, ecc. Per la preparazione delle librerie si può scegliere la cattura per ibridazione o l'amplificazione. Il controllo di qualità di questa fase deve stabilire i requisiti corrispondenti per la concentrazione di acido nucleico, la purezza e la distribuzione dei frammenti nell'estrazione dell'acido nucleico e rispettare l'implementazione. L'"esperimento a secco" comprende ogni fase del processo di analisi bioinformatica e il controllo di qualità in questa fase dovrebbe riguardare la profondità minima di sequenziamento, la profondità media di sequenziamento, l'uniformità di copertura, il contenuto di guanina e citosina (GC), il valore di qualità della chiamata di base, il confronto del valore di qualità e il tasso di on-target, ecc. La fase post-analitica comprende l'interpretazione del referto del test, la discussione sul comitato molecolare per i tumori (MTB) e la consulenza genetica

Strategie di costruzione delle librerie Le strategie di sequenziamento mirato per il rilevamento del ctDNA con metodi NGS si dividono principalmente in due tipi: NGS basato sulla cattura ibrida (hybrid capture NGS) e NGS basato sull'amplificazione (amplification-based NGS). Il metodo NGS mirato basato sulla cattura ibrida è un metodo in cui la sonda di cattura si ibrida con una regione specifica del genoma per ottenere e analizzare la sequenza della regione target. Questo metodo prevede molte fasi operative e il processo è relativamente complicato. Sono necessari 1~2 giorni per completare la costruzione della libreria e passare al computer. È in grado di rilevare mutazioni puntiformi, inserzioni e delezioni di piccoli frammenti e variazioni del numero di copie, nonché riarrangiamenti genici a livello del DNA, e si possono trovare alcune fusioni sconosciute. la sensibilità di rilevamento può raggiungere oltre il 95%. Le sonde utilizzate nella costruzione della libreria del metodo di cattura della sequenza bersaglio sono progettate con sonde a DNA e sonde a RNA, principalmente per l'arricchimento mirato della regione bersaglio, per garantire l'arricchimento completo della sequenza bersaglio del campione, per migliorare l'efficienza dell'arricchimento e l'uniformità della copertura e per ridurre efficacemente il costo del sequenziamento. Gli approcci NGS mirati basati su ampliconi si basano su più fasi di amplificazione PCR per arricchire le sequenze target. Durante gli esperimenti, il tempo effettivo di lavoro per la preparazione delle librerie basate sull'amplificazione è solitamente più breve rispetto ai metodi di cattura ibridi. Indipendentemente dal metodo utilizzato, è necessario stabilire criteri chiari per le librerie idonee per ogni analisi.

Riassumere

L'emergere della biopsia liquida è il miglioramento dell'attuale sistema di rilevamento dei tumori. La biopsia liquida può rilevare tracce di tumori nell'organismo in una fase precoce ed è un metodo importante per lo screening precoce dei tumori. Inoltre, rispetto alla biopsia tissutale prelevata direttamente dal tessuto tumorale, il materiale della biopsia liquida deriva dal sangue, che è meno invasivo e conveniente per il monitoraggio in tempo reale. L'effetto positivo è un'importante tecnologia di diagnosi e trattamento dei tumori.

riferimenti

[1]. Consenso degli esperti sulla pratica clinica del sequenziamento high-throughput del ctDNA (edizione 2022)

[2].Sequenziamento di nuova generazione (NGS): uno strumento d'oro nella strumentazione forense PMID: 27543959

[3].Rilevanza clinica dell'analisi del ctDNA su base ematica: individuazione delle mutazioni e oltre.PMCID: PMC7852556

[4].Tracciare la progressione del cancro: dalle cellule tumorali circolanti alle metastasi.PMCID: PMC7082968