Breve discussione sulla tecnologia della PCR quantitativa in tempo reale a fluorescenza

Breve discussione sulla tecnologia della PCR quantitativa in tempo reale a fluorescenza

Attualmente, in base alle diverse sostanze chimiche fluorescenti utilizzate nella PCR quantitativa fluorescente in tempo reale, la tecnologia della PCR quantitativa fluorescente si divide principalmente in due categorie: coloranti fluorescenti e sonde fluorescenti. I coloranti fluorescenti sono un metodo di rilevamento non specifico delle sequenze amplificate e sono i primi metodi utilizzati nella PCR quantitativa a fluorescenza. Le sonde fluorescenti sono una tecnologia di PCR quantitativa a fluorescenza basata sul principio del trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza (FRET).

Il colorante fluorescente

Il metodo dei coloranti fluorescenti è noto anche come colorazione con legame al DNA. I coloranti che legano il DNA sono le prime sostanze chimiche utilizzate nella PCR quantitativa a fluorescenza. La principale molecola di colorante attualmente utilizzata è il SYBR Green I. Il SYBR Green I può legarsi specificamente al solco minore dei doppi filamenti di DNA. Il SYBR Green I libero non ha quasi alcun segnale di fluorescenza, ma dopo essersi legato al DNA, il suo segnale di fluorescenza può aumentare di centinaia di volte. Pertanto, maggiore è il numero di prodotti amplificati dalla PCR, maggiore è la quantità di SYBR Green Ⅰ legata e più forte sarà il segnale di fluorescenza [1], in grado di quantificare qualsiasi gene target.

il principio di base del SYBR GreenⅠluminosità

Sonda di idrolisi

Le sonde di idrolisi sono rappresentate dalle sonde TaqMan, note anche come sonde esonucleasiche. La tecnologia TaqMan è un tipo di tecnologia PCR quantitativa fluorescente in tempo reale ricercata e sviluppata dall'azienda americana PE nel 1996, ed è stata ampiamente utilizzata nella rilevazione quantitativa dei geni [2,3]. Il principio di base consiste nell'utilizzare l'attività esonucleasica 5' dell'enzima Taq, che possiede un'attività esonucleasica naturale 5'-3', in grado di tagliare i nucleotidi all'estremità 5' del DNA a doppio filamento e di rilasciare un singolo acido oligonucleotidico.

principio di base del TaqMan

confronto dei vantaggi e degli svantaggi dei metodi

Principi tecnici dei prodotti SpaceGen:

Dopo una serie di trasformazioni, la citosina (C) non metilata può essere convertita in uracile (U). Dopo la reazione di PCR, l'uracile (U) viene infine convertito in timina (T), cioè in citosina (C) non metilata. La pirimidina (C) sarà infine convertita in timina (T); la citosina metilata (C) non cambierà durante la reazione di modificazione a causa dell'effetto protettivo del suo gruppo metilico, cioè la citosina metilata (C) viene convertita in citosina (C).

I prodotti SpaceGen per la rilevazione della metilazione utilizzano la tecnologia PAP-ARMS® per completare la rilevazione PCR quantitativa fluorescente del genoma modificato e combinano la reazione di attivazione dell'idrolisi del pirofosfato con il principio della tecnologia ARMS tradizionale. Per il rilevamento sono stati utilizzati il metodo della sonda TaqMan e il processo sperimentale di estrazione degli acidi nucleici-modifica della metilazione- PCR a fluorescenza.

Riferimenti

1、Proc Nat Acad Sci USA，1996，93：14509-14514.

3、Clin Chem Lab Med，1998，36：587-588.

4、Nat Genet，1993，4（3）：289-294.