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Applicazioni e considerazioni sulla rilevazione della metilazione del gene MLH1

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Applicazioni e considerazioni sulla rilevazione della metilazione del gene MLH1

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Prefazione

La metilazione della regione promotrice del gene MLH1 è un'alterazione epigenetica comune nel cancro del colon-retto (CRC) e dell'endometrio (EC), che porta al silenziamento del gene e alla conseguente instabilità dei microsatelliti (MSI-H). In genere, alti livelli di metilazione di MLH1 sono considerati eventi sporadici nel cancro e il suo rilevamento è considerato uno strumento utile per distinguere le malattie sporadiche da quelle ereditarie (sindrome di Lynch). Esistono anche alcune applicazioni estese della metilazione di MLH1 nella diagnosi e nel trattamento del cancro dell'endometrio.

Applicazione della metilazione MLH1 nello screening della sindrome di Lynch

La sindrome di Lynch, nota anche come sindrome del cancro colorettale ereditario non poliposico (HNPCC) (OMIM 120435), rappresenta circa il 2%-4% di tutti i casi di CRC e il 3%-5% di tutti i casi di EC. È causata da mutazioni germinali nei geni di mismatch repair (MMR) MLH1, MSH2, MSH6 e PMS2 ed è associata a MSI-H nel tessuto tumorale. I pazienti Lynch hanno un rischio più elevato di sviluppare CRC e EC (rispettivamente fino all'80% e al 60%) e sono anche a rischio di altri tipi di cancro (come il cancro gastrico, il cancro dell'intestino tenue, il carcinoma uroteliale e il cancro ovarico). Le variazioni nei geni MLH1 e MSH2 rappresentano la maggior parte dei casi di sindrome di Lynch, con tassi di incidenza rispettivamente del 40-50% e del 40-60%, mentre i tassi di incidenza di MSH6 (10-20%) e PMS2 (2%) sono inferiori.

Nella pratica clinica, il test immunoistochimico della proteina MMR è generalmente raccomandato come una priorità per i pazienti con tumore correlato alla sindrome di Lynch. Quando si verifica la perdita della proteina MLH1, la metilazione del promotore del gene MLH1 o il test BRAF V600E (applicabile solo al CRC) sono comunemente utilizzati per interpretare i tumori sporadici. La mutazione patogena BRAF V600E si trova solo nel 69% dei CRC metilati, quindi l'assenza di mutazione BRAF V600E non esclude la metilazione di MLH1. La frequenza delle mutazioni del gene BRAF nei pazienti affetti da EC è estremamente bassa e non è correlata alla metilazione del promotore del gene MLH1, pertanto lo screening per la sindrome di Lynch non richiede il test per la mutazione BRAF V600E.

Algoritmo di screening per la sindrome di Lynch nei pazienti affetti da EC raccomandato dalla Consensus di Manchester

Sebbene la metilazione del promotore di MLH1 e le mutazioni germinali di MLH1 siano generalmente considerate due meccanismi mutuamente esclusivi, esistono ancora alcuni rari casi in cui si osserva un'elevata metilazione di MLH1 in individui con mutazioni germinali patogene di MLH1 o portatori di epimutazioni. La metilazione sistemica di MLH1 potrebbe rappresentare un hit secondario che silenzia MLH1 nella sindrome di Lynch. Un recente studio condotto in Italia ha analizzato 56 pazienti affetti da sindrome di Lynch utilizzando tecniche di sequenziamento high-throughput (NGS) e di amplificazione multiplex ligation-dependent probe (MS-MLPA) metilazione-specifica. Tra i pazienti con mutazioni germinali patogene di MLH1, il 16,7% (3/18) dei tumori colorettali (CRC) e il 40% (4/10) dei tumori endometriali (EC) presentavano promotori di MLH1 altamente metilati. Sebbene si tratti di un singolo studio con un numero limitato di casi, sottolinea l'importanza di considerare l'anamnesi familiare e personale dei pazienti. Quando la sindrome di Lynch è fortemente sospettata dal punto di vista clinico, indipendentemente dallo stato della MMR, è necessario eseguire il test per le mutazioni germinali del gene correlato alla sindrome di Lynch per conferma.

Applicazione della metilazione di MLH1 nella prognosi del tumore dell'endometrio

La metilazione del promotore del gene MLH1 è associata alla prognosi del carcinoma endometriale (EC). Uno studio condotto in Giappone ha analizzato 527 campioni di EC utilizzando l'immunoistochimica e la MS-MLPA, di cui 419 casi (79,5%) erano proficient mismatch repair (pMMR), 65 casi (12,3%) erano sospetti di sindrome di Lynch (perdita delle proteine MSH2/MSH6 o perdita delle proteine MLH1/PMS2 ma MLH1 non metilato) e 43 casi (8,2%) erano met-EC (perdita delle proteine MLH1/PMS2 e MLH1 altamente metilato). Rispetto ai pazienti con sospetta sindrome di Lynch, l'EC con metilazione di MLH1 aveva una prognosi significativamente peggiore.

Analisi della sopravvivenza di ciascun sottogruppo

La metilazione di MLH1 è anche associata alla prognosi dell'immunoterapia dell'EC. Uno studio di fase II in aperto, a braccio singolo (NCT02899793) ha valutato l'efficacia di pembrolizumab in pazienti con EC dMMR/MSI-H ricorrente, con una dose di 200 mg Q3W per iniezione endovenosa per 24 mesi. Gli endpoint primari erano ORR secondo i criteri RECIST v1.1 ed eventi avversi, mentre gli endpoint secondari includevano PFS e OS. Diciannove pazienti presentavano metilazione del promotore di MLH1, sei pazienti avevano tumori Lynch-like, un paziente li aveva entrambi e non c'erano pazienti con sindrome di Lynch con mutazioni germinali. A un follow-up mediano di 25,8 mesi, l'ORR è stato del 100% nei pazienti Lynch-like rispetto al 44% dei pazienti metilati (p=0,024). La PFS a 3 anni è stata del 100% rispetto al 30% (p=0,017) e la OS del 100% rispetto al 43% (p=0,043).

Grafico a cascata della risposta tumorale

Analisi di sopravvivenza tra sottogruppi

Applicazione della metilazione di MLH1 nella sottotipizzazione molecolare del cancro endometriale

Sebbene la metilazione del promotore del gene MLH1 non sia un marcatore per la sottotipizzazione molecolare del carcinoma endometriale (EC), essa svolge un ruolo suggestivo nella sottotipizzazione molecolare, soprattutto quando i risultati di diverse metodologie sono incoerenti. Questo punto è stato argomentato in un articolo recentemente pubblicato dal Dipartimento di Patologia del Terzo Ospedale dell'Università di Pechino sul Chinese Journal of Obstetrics and Gynecology, intitolato "Comprehensive evaluation of mismatch repair and microsatellite instability status in molecular subtyping of endometrial cancer" L'articolo ha analizzato 214 casi di pazienti con EC utilizzando l'immunoistochimica MMR e la NGS (prodotti non fluorescenti). Per le pazienti i cui risultati del rilevamento MMR-IHC non corrispondevano ai risultati del rilevamento MSI-NGS, sono stati eseguiti ulteriori rilevamenti MSI-PCR e il rilevamento della metilazione del promotore del gene MLH1 (prodotti fluorescenti).

Tra i 40 pazienti sporadici con EC di tipo MMR-d, è stata osservata la perdita dell'espressione della proteina MLH1 e/o PMS2 in 31 casi, tra cui 20 casi hanno mostrato la metilazione del promotore del gene MLH1, 1 caso non ha mostrato metilazione e la rilevazione della metilazione non è stata eseguita in 10 casi a causa dell'insufficienza del tessuto tumorale.

Un totale di 9 pazienti ha avuto risultati incoerenti tra la rilevazione MMR-IHC e MSI-NGS, includendo principalmente pazienti con perdita condivisa dell'espressione delle proteine MLH1 e PMS2 o perdita subclonale. Tra questi, 6 casi mostravano una metilazione del promotore del gene MLH1. Tra i 3 pazienti i cui risultati della verifica MSI-PCR erano MSI-L, 2 pazienti avevano valori di TMB più elevati e presentavano metilazione del promotore del gene MLH1, classificati quindi anche in MMR-d. Un paziente non è stato sottoposto alla rilevazione MSI-PCR a causa della quantità insufficiente di campioni di DNA, ma è stata osservata una perdita combinata dell'espressione delle proteine MLH1 e PMS2 ed è stata rilevata la metilazione del promotore del gene MLH1, il che soddisfa anche i criteri per la classificazione MMR-d.

Analisi dettagliata dei risultati di rilevamento incoerenti tra MMR-IHC e MSI-NGS

I risultati dei test MMR-IHC e MSI-NGS sono incoerenti e si riscontrano comunemente in uno stato di elevata metilazione del promotore del gene MLH1 che porta alla perdita concomitante dell'espressione delle proteine MLH1 e PMS2 o alla perdita del sottoclone della proteina MMR. I test di metilazione del gene MLH1 dovrebbero essere combinati, se necessario, per valutare in modo completo lo stato MMR e MSI e fornire un'accurata sottotipizzazione molecolare dei pazienti con EC.

Sintesi

Per l'EC con perdita di espressione della proteina MLH1, il test di metilazione del promotore del gene MLH1 aiuta a chiarire lo stato MMR e MSI del tumore, a escludere il rischio di sindrome di Lynch, a indicare la prognosi dell'EC, a contribuire alla selezione dei piani di trattamento e a fornire indicazioni supplementari per la sottotipizzazione molecolare.

Riferimenti

[1] NCCN Genetic/Familial High-Risk Assessment: Cancro colorettale 2023 v2

[2] Raccomandazioni del gruppo di consenso internazionale di Manchester 2019: Management of Lynch syndrome gynecological tumors (Gestione dei tumori ginecologici con sindrome di Lynch)

[3] Consenso degli esperti cinesi sui test molecolari per il cancro dell'endometrio (edizione 2021)

[4] Genes (Basilea). 2023 Nov 9;14(11):2060.

[5] J Gynecol Oncol. 2021 Nov;32(6):e79.

[6] Cancer. 2022 Mar 15;128(6):1206-1218.

[7] Chinese Journal of Obstetrics and Gynecology Ottobre 2023; Vol. 58, No. 10

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